質(zhì)粒dna的提取、純化和電泳檢測

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1、質(zhì)粒DNA的提取、純化和電泳檢測姓名學號同組人班級實驗時間摘要：質(zhì)粒是細菌細胞中與主染色體共存、可自主復(fù)制的一段大多數(shù)呈環(huán)形的DNA，它是基因工程中一種非常重要的載體。質(zhì)粒DNA的提取成為分子生物學實驗室一項最基本的工作。堿變性提取法是一種應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法。電泳是帶電物質(zhì)在電場中向著與其電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。凝膠電泳可用于分離、鑒定和純化DNA片段，是分子生物學的核心技術(shù)之一。本次實驗利用堿變法對E.coliDH5受體菌中質(zhì)粒pUC19的DNA進行提取、純化和電泳檢測，旨在學習并掌握質(zhì)粒DNA提取的原理、純化及

2、瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)。通過此次實驗，我們達到了預(yù)期效果。關(guān)鍵詞：質(zhì)粒DNA、堿變性提取法、質(zhì)粒DNA的純化、DNA凝膠電泳1.引言質(zhì)粒是細菌細胞中與主染色體共存、可自主復(fù)制的一段大多數(shù)呈環(huán)形的DNA。細菌質(zhì)粒的相對分子質(zhì)量大小從1kb至200kb以上不等。一些質(zhì)粒永遠獨立于染色體之外，另外一些質(zhì)粒在一定條件下會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過細胞分裂傳遞到后代。質(zhì)粒在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。目前，已發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒的細菌有幾百種，已知的絕大多數(shù)的細菌質(zhì)粒都是閉合環(huán)狀DNA分子（簡稱cccDNA）。由于質(zhì)粒分

3、子小、便于分離和提取的特點，在DNA重組中，質(zhì)?；蚪?jīng)過改造后的質(zhì)粒可通過連接外源基因構(gòu)成重組體，攜帶目的基因進入細菌、動物細胞或植物體內(nèi)進行擴增與表達，因此質(zhì)粒是基因工程中一種非常重要的載體。質(zhì)粒特征的分析已被廣泛用于細菌種屬鑒定、耐藥性、毒力及同源性分析。近年來由于基因芯片技術(shù)的出現(xiàn)，質(zhì)?；蛱结樀拈_發(fā)和應(yīng)用也得到了飛速的發(fā)展，所以這就要求我們從宿主細胞中提取高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA。因此，質(zhì)粒DNA的提取成為分子生物學實驗室一項最基本的工作。提取和純化質(zhì)粒DNA的方法很多，目前常用的有：堿裂解/堿變性法、煮沸法、羥基磷灰石柱層析法、E

4、B-氯化銫密度梯度離心法和Wizard法等。其中，堿變性提取法最為經(jīng)典和常用，是一種應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達到分離目的，適用于不同量質(zhì)粒DNA的提取。該方法操作簡單，易于操作，一般實驗室均可進行。提取的質(zhì)粒DNA純度高，可直接用于酶切、序列測定及分析。堿變性提取質(zhì)粒DNA一般包括三個基本步驟：培養(yǎng)細菌細胞以擴增質(zhì)粒；收集和裂解細胞；分離和純化質(zhì)粒DNA。在細菌細胞中，染色體DNA以雙螺旋結(jié)構(gòu)存在，質(zhì)粒DNA以共價閉合環(huán)狀形式存在。細胞破碎后，染色體DNA和質(zhì)粒DNA均被

5、釋放出來，但是兩者變性與復(fù)性所依賴的溶pH值不同。在pH12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性；質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)狀的兩條互補鏈不會完全分離。當用pH值4.8的KAc（或NaAc）高鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)堿性溶液至中性時，變性的質(zhì)粒DNA可恢復(fù)原來的共價閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)而溶解于溶液中；但染色體DNA不能復(fù)性，而是與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起形成纏連的、可見的白色絮狀沉淀。這種沉淀通過離心，與復(fù)性的溶于溶液的質(zhì)粒DNA分離。溶于上清液的質(zhì)粒DNA，可用無水乙醇和鹽

6、溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA和RNA性質(zhì)類似，乙醇沉淀DNA的同時，也伴隨著RNA沉淀，可利用RNaseA將RNA降解。質(zhì)粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通過酚/氯仿抽提除去，最后獲得純度較高的質(zhì)粒DNA。電泳是帶電物質(zhì)在電場中向著與其電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。各種生物大分子在一定pH條件下，可以解離成帶電荷的離子，在電場中會向相反的電極移動。凝膠是支持電泳介質(zhì)，它具有分子篩效應(yīng)。含有電解液的凝膠在電場中，其中的電離子會發(fā)生移動，移動的速度可因帶電離子的大小、形態(tài)及電荷量的不同而有差異。利用移動速度差異，就

7、可以區(qū)別各種大小不同的分子。因而，凝膠電泳可用于分離、鑒定和純化DNA片段，是分子生物學的核心技術(shù)之一。凝膠電泳技術(shù)操作簡單而迅速，分辨率高，分辨范圍極廣。此外，凝膠中DNA的位置可以用低濃度熒光插入染料如EB染色直接觀察到，甚至含量少至20pg的雙鏈DNA在紫外激發(fā)下也能直接檢測到。溴化乙錠（EB）是一種具扁平分子的核酸染料，可以插入到DNA或RNA分子的堿基之間，并在300nm波長的紫外光照射下放射出熒光，所以可用來顯現(xiàn)凝膠中的核酸分子。在適當?shù)娜旧珬l件下，熒光的強度是同DNA片段的大小（或數(shù)量）成正比。核酸在溶液中由于磷酸基而

8、帶負電荷，在電場中向正極移動。DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳遷移速率主要取決于下面六個因素：（1）樣品DNA分子的大?。弘娪緯r，線性雙螺旋DNA分子是以頭尾位向前遷移的，其遷移速度與分子量（所含堿基）的對數(shù)值成反比，這是因為大分子有更大的