資源描述：
《質粒DNA的提取及電泳檢測.docx》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、實驗質粒DNA的提取及電泳檢測一實驗目的通過本實驗學習掌握堿裂解法提取細菌質粒DNA。二實驗原理1.細菌中有兩種DNA，即染色體DNA和質粒DNA。2.質粒DNA的提取方法有三種：堿裂解法，煮沸法，去污劑（如Triton和SDS）裂解法。3.堿裂解法比較劇烈，可破壞堿基配對，使宿主細胞DNA變性，共價閉合環(huán)狀DNA由于空間纏繞，兩條鏈不會徹底分開。當外界條件到達復性條件時，質粒DNA的雙鏈又迅速恢復原狀，而較大的線性染色體DNA難以復性。三實驗材料：轉化后的細菌(含有質粒的大腸桿菌)四、實驗用具和藥品1
2、.實驗用具:搖床，離心機，移液器及槍頭，玻璃試管（15mL）及塞子，離心管（1.5mL）2.實驗試劑：（1）溶液I50mmol/L25mmol/L10mmol/L葡萄糖三羥甲基氨基甲烷（Tris）Tris乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）·HCl（pH8.0）（2）溶液II0.4mol/LNaOH，2%SDS，用前等體積混合（3）溶液III5mol/L乙酸鉀60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml（4）TE緩沖液10mmol/LTris·HCl（pH8.0）1mmol/LEDT
3、A（pH8.0）（5）70%乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回）（6）加樣緩沖液（6X）：40%蔗糖、0.25%溴酚蘭（7）電泳緩沖液：0.045mol/LTris-硼酸0.001mol/LEDTA（0.5XTBEbuffer）電泳緩沖液貯存液：5X：54gTris堿、27.5g硼酸、20ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）五實驗步驟（一）細菌繁殖挑取白色的單菌落若干，轉移到3mL液體LB培養(yǎng)基(附加100mg/mlAmp),37℃過夜振蕩（200r/min）培養(yǎng)。（二）菌體收集將過夜培養(yǎng)的菌體轉
4、入1.5mL離心管，離心30sec5000r/min；棄上清提取質粒（三）質粒提取方法一：堿裂解法提取質粒DNA1．.將上述沉淀重懸于250μL冰預冷的溶液Ⅰ中，劇烈震蕩；2．加入250μL溶液Ⅱ，蓋緊管口，快速顛倒離心管5~10次；3．加入350μL冰預冷的溶液Ⅲ，蓋緊管口，溫和地顛倒離心管5~10次；9000r/min離心5min上清轉移到另一新1.5mL離心管中；4．加等體積氯仿，振蕩混合，靜置，9000r/min離心5min，上清轉移到另一新1.5mL離心管中；5．加入1/10體積3mol/L的
5、醋酸鈉和2倍體積的乙醇，充分混勻，靜置5min；9000r/min離心5min；6．棄上清，用70％ethanol洗滌；7．加30μLTE溶解，-20℃保存。方法二：試劑盒提取方法1.離心收集的菌體中加入含RNAase的溶液Ⅰ250μL，重懸菌體，不應留有小的菌塊；2.加溶液Ⅱ250μL，輕輕顛倒離心管4-6次，使菌體充分裂解，至溶液澄清；3.加入350μL冰預冷的溶液Ⅲ，溫和并充分地上下翻轉混合6-8次；4.12000r/min離心10min；5.將上清轉移到DNA結合管（置于2ml離心管中），120
6、00r/min離心1min，棄濾液；6.將制備管置回離心管，加入去蛋白試劑500μL，12000r/min離心1min，棄濾液；7.將制備管置回離心管，加洗滌液700μL，12000r/min離心1min，棄濾液；以同樣的方法再用700μL洗滌液洗滌一次，棄濾液。8.將制備管置回2ml離心管中，12,000×g離心1min，去除殘余的洗滌液；10將DNA結合柱放入另一個新的1.5mL離心管中，在制備管膜中央加60-80μL洗脫液或去離子水，室溫靜置1min。12,000×g離心1min。（四）檢測提取D
7、NA質量的電泳檢測。取4ul質粒DNA+2ul加樣緩沖液+6ulddH2O；配制1%的瓊脂糖凝膠電泳30min，EB染色，拍照。注意事項：氯仿對眼睛、皮膚、粘膜及呼吸道都有刺激作用，它是致癌劑并可損傷肝臟和腎臟，操作時需戴手套、口罩。六實驗作業(yè)1.思考本實驗的關鍵步驟是什么？2.瓊脂糖電泳鑒定質粒DNA時，能看到幾條帶，快慢順序是什么？3.附上電泳圖片。（注：專業(yè)文檔是經(jīng)驗性極強的領域，無法思考和涵蓋全面，素材和資料部分來自網(wǎng)絡，供參考?？蓮椭啤⒕幹?，期待你的好評與關注）
