檢定菌保存、傳代、使用、銷毀標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

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1、檢定菌保存、傳代、使用、銷毀標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程1．目的：規(guī)范藥品微生物學(xué)檢定用菌的管理，最大限度降低變異率，確保菌種的溯源性與穩(wěn)定性，從而確保微生物學(xué)檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。2．依據(jù)：ChP2010版（一部）、《中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》（2010年版）。3．范圍：本規(guī)程適用于檢定用菌種的管理，包括菌種的申購、保存、傳代、使用及銷毀等。4．責(zé)任：4.1.QC主管負(fù)責(zé)菌種的申購、接受、保存、分發(fā)。4.2.微生物檢驗員負(fù)責(zé)菌種的確認(rèn)、傳代、使用及銷毀。5.相關(guān)文件及術(shù)語：5.1．術(shù)語標(biāo)準(zhǔn)菌種是指由中國藥品生物制品檢定所醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心提供的冷凍干燥菌。

2、傳代用菌種是指用標(biāo)準(zhǔn)菌種制備的采用特定保存方法長期固定保存的菌種，用于傳代及制備工作用菌種。工作用菌種是指用標(biāo)準(zhǔn)菌種或傳代用菌種接種至普通瓊脂斜面培養(yǎng)后，作為日常工作使用的菌種。菌種的代是指將其接種至一新鮮培養(yǎng)基上或培養(yǎng)基內(nèi)，每萌發(fā)一次即稱為一代，從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代。6.標(biāo)準(zhǔn)：6.1．檢定菌的申購QC主管每年根據(jù)檢定菌種的使用情況（包括臨時檢驗需要），提出購買計劃，交由質(zhì)量管理部部長審批后，向中檢所菌種保藏中心或?。ㄊ校┧帣z所購買凍干菌種（標(biāo)準(zhǔn)菌種）；也可以直接向?。ㄊ校┧帣z所購買傳代用菌種，購買時，需詢問與確定菌種的代數(shù)，以

3、便傳代時控制代數(shù)。6.2．檢定菌的接收菌種到達(dá)實驗室后，由QC主管接收菌種，檢查其名稱和數(shù)量，以及每一支的完整性，同時將菌種的所有信息，填寫在《檢定菌接收記錄》（附表1）上，內(nèi)容包括：名稱、數(shù)量、編號（無編號者按檢定菌種的編號原則編號）、代數(shù)、來源、接收日期、接收人等，并將其暫貯存于4～8℃冰箱中，在一周內(nèi)必須完成轉(zhuǎn)種。6.3．檢定菌的保存6.3.1．工作用菌種的保存工作用菌種采用斜面低溫保存法。將菌種接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，待菌生長充分以后，轉(zhuǎn)移至4～8℃冰箱中保存。此法僅用于工作用菌種的短期保存，并應(yīng)隨時檢查其污染雜菌和變異等情況，發(fā)現(xiàn)異

4、常情況，經(jīng)應(yīng)滅活處理后銷毀。保存時間根據(jù)菌種種類而不同，細(xì)菌：1個月；酵母菌：2個月；霉菌及芽胞：3個月。6.3.2．傳代用菌種的保存采用甘油冷凍管保藏法或液體石蠟保存法。6.3.2.1．甘油冷凍管保存法用無菌接種環(huán)輕輕刮取經(jīng)冷凍復(fù)溶增菌后并接種至平板或瓊脂斜面的菌苔，并通過接種環(huán)與試管壁之間的輕輕摩擦而使細(xì)菌充分?jǐn)U散到預(yù)先裝入試管中的無菌純化水中，調(diào)整菌液濃度，使其等同于10號比濁管，向已制備好的菌懸液中加入等體積的無菌甘油（濃度20%），即為10%甘油菌懸液，輕輕振搖，使內(nèi)容物充分混合，分裝于無菌小試管，在-30℃冷凍條件下保存。此甘油冷凍管為

5、第2代（G2）?？梢悦扛?年轉(zhuǎn)種一代。使用時，取出一支放至室溫，轉(zhuǎn)種增菌培養(yǎng)或接種至瓊脂斜面復(fù)蘇，挑取純菌落傳代或工作用。此種方法主要適用于需氧細(xì)菌和酵母菌的保藏（如大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌）。6.3.2.2．液體石蠟保存法6.3.2.2.1．無菌液體石蠟的制備：選用優(yōu)質(zhì)化學(xué)純液體石蠟，將液體石蠟分裝加塞，用牛皮紙包好，在121℃滅菌30分鐘,置40℃恒溫箱中蒸發(fā)水分，經(jīng)無菌檢查后備用。6.3.2.2.2．液體石蠟管的制備：將菌種穿刺接種于半固體高層培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng)結(jié)束后，在層流臺下用無菌吸管吸取上述無菌液體石蠟至培養(yǎng)

6、好的菌種管內(nèi)，并使石蠟高出菌種表面約1cm使菌體與空氣隔絕，并將試管直立，置于-20℃冷凍或2～8℃冰箱中保存。此法主要適用于霉菌、厭氧菌、放線菌、芽孢桿菌的保存（如枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌等）。6.3.3．各菌種的保存方法、條件及期限，見《傳代用菌種保存方法、保存溫度、保存期限》（附件1）。6.4．檢定菌的傳代檢定菌菌種的傳代因凍干菌（標(biāo)準(zhǔn)菌種）與傳代用菌種而不完全相同。6.4.1．標(biāo)準(zhǔn)菌種的復(fù)蘇、確認(rèn)、傳代6.4.1.1．標(biāo)準(zhǔn)菌種的復(fù)蘇6.4.1.1.1．把凍干菌種管、滅菌毛細(xì)滴管（1ml）、雙碟、鑷子、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（或其它適宜培養(yǎng)

7、基）數(shù)支，移入接種室或超凈工作臺。6.4.1.1.2．將凍干菌種管外壁用碘酒擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦凈，放在滅菌雙碟內(nèi)，待干。點燃酒精燈，將標(biāo)準(zhǔn)菌種管的封口一端在火焰上，燒灼紅熱，用滅菌毛細(xì)滴管吸取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（或其它適宜的培養(yǎng)基），滴在灼熱的菌種管封口一端，使驟冷而炸裂。6.4.1.1.3．取滅菌鑷子，在火焰旁，將炸裂的管口打開，放入滅菌雙碟內(nèi)，另取1支滅菌毛細(xì)滴管，在火焰旁吸取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（或其它適宜的培養(yǎng)基）少許，加至菌種管底部，將凍干菌塊攪動促使溶解，隨即吸出管內(nèi)菌液，接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（或其它適宜的培養(yǎng)基）內(nèi)，并根據(jù)不同菌種

8、類型而將其培養(yǎng)于相宜的溫度下24～72小時（細(xì)菌需要24～48的培養(yǎng)物，酵母菌需要72小時的培養(yǎng)物，形成孢子的微生物則宜保