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1、吸煙者樹(shù)突狀細(xì)胞的功能狀態(tài)研究分析論文.freelokingperson.MethodsDCshumanperipherybloodmonocytecells(PBMCs)uponcultureacrophagecolonystimulatingfactor(GM-CSF)fromsmokingperson.Thesurfaceco-stimulatoryfactorCD86(7-2)ofDCsetry.Immunostimulatorycapacityeasuredbymixedlymphocytereaction(MLR).EL
2、ISAoreCD86smokingperson.ThestimulatingcapacityofDCsinMLRphocytesinMLRproducedhigherlevelsofpro-inflammationcytokinesandlomationcytokines.freelalgroup.ConclusionDCsofsmokingpersonareactivated，ayplayanimportantroleintheprogressofatherosclerosis(AS).近年發(fā)現(xiàn)免疫炎性反應(yīng)在促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化(at
3、herosclerosis，AS)發(fā)病中起重要作用［１］。研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職性抗原提呈細(xì)胞樹(shù)突狀細(xì)胞(dendriticcell，DC)在AS斑塊中聚集增多，提示其所介導(dǎo)免疫炎性反應(yīng)參與了AS的發(fā)生和發(fā)展［２］。吸煙是心腦血管疾病的重要危險(xiǎn)因素之一［３］，有觀察表明吸煙可激活體內(nèi)的炎性反應(yīng)［４］，但吸煙是否影響DC功能從而促進(jìn)AS的發(fā)生與發(fā)展，目前尚少有報(bào)道。本文通過(guò)觀察吸煙者DC的功能狀態(tài)，進(jìn)一步闡明吸煙致AS的可能機(jī)制。1對(duì)象與方法1.1研究對(duì)象選取吸煙和非吸煙者各30例，兩組年齡、性別等無(wú)明顯差異。所有對(duì)象均排除急慢性
4、炎性疾病、自身免疫性疾病及腫瘤，未用激素及免疫抑制劑。1.2材料RPMI1640(L-glutamine)培養(yǎng)基、胎牛血清(FCS)購(gòu)自Gibco公司；淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)笊镏破酚邢薰荆凰倪螓}(MTT)、二甲亞砜(DSMO)購(gòu)自廣州威佳公司；重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重組人白介素-4(rhIL-4)購(gòu)自英國(guó)Peprotech公司；PE標(biāo)記的鼠抗人CD86(B7-2)單抗購(gòu)自Biolegend公司；白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白介素-10(IL-10)ELISA試劑盒購(gòu)自美晶公司。1.3方法1
5、.3.1DC制備抽取受試者外周血20ml，淋巴細(xì)胞分離液中離心(2000r/min，20min)，收集單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，PBS沖洗2次，RPMI1640沖洗1次，用完全RPMI1640(含10%FCS)在6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)2h(37℃，5%CO2)，去掉非貼壁細(xì)胞。貼壁細(xì)胞用完全RPMI1640(含10%FCS、rhGM-CSF100ng/ml、rhIL-4500u/ml)培養(yǎng)液，置37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)7天，隔天半量換液1次。收集培養(yǎng)第7天的懸浮細(xì)胞即DC進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1.3.2DC形態(tài)于培養(yǎng)第1、3、5、7天在倒置顯微鏡下
6、觀察DC形態(tài)。1.3.3流式細(xì)胞學(xué)分析收集DC細(xì)胞，用PE標(biāo)記的CD86(B7-2)單抗標(biāo)記細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀(FACS，美國(guó)BectonDickinson)檢測(cè)。1.3.4混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)反應(yīng)中淋巴細(xì)胞來(lái)自其他健康供血員的PBMC，經(jīng)T細(xì)胞尼龍毛柱分離后，得到純的T淋巴細(xì)胞。濃度為2×１０５/ml的T淋細(xì)胞與濃度為2×１０４/ml的DC各100μl在96孔平底培養(yǎng)板中37℃、5%CO2條件下混合培養(yǎng)，第4天吸取上清液-20℃保存待測(cè)細(xì)胞因子，沉淀細(xì)胞加MTT液(25μl/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后每孔加DMSO100μl，波長(zhǎng)
7、570nm處測(cè)A值。1.3.5細(xì)胞因子測(cè)定酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)分別檢測(cè)保存的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)上清液IL-1β和IL-10濃度，操作嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS10.0軟件系統(tǒng)分析，所有資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間差異用t檢驗(yàn)(Independent-SamplesTtest)。P＜0.05為差異有顯著性。2結(jié)果2.1DC形態(tài)學(xué)特點(diǎn)光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞表面伸出樹(shù)突樣結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)短不一，呈簇狀生長(zhǎng)，為典型的DC細(xì)胞。吸煙者和非吸煙者DC在形態(tài)上無(wú)差別。2.2吸煙者DC的功能吸煙者DC表面CD86表
8、達(dá)明顯高于非吸煙者(P＜0.001)，吸煙者DC刺激T淋巴細(xì)胞增殖能力顯著高于對(duì)照組(P＜0.001)。如表1所示。表1吸煙者DC功能(x±s)注：與非吸煙組比較，*Ｐ＜0.0012.3細(xì)胞因子測(cè)定吸煙者M(jìn)LR上清液中促炎細(xì)胞因子IL
