新生大鼠大腦皮質星形膠質細胞的體外培養(yǎng)論文

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1、新生大鼠大腦皮質星形膠質細胞的體外培養(yǎng)論文謝裕華易春智項曉偉劉建仁【摘要】目的建立新生大鼠大腦皮質星形膠質細胞體外培養(yǎng)的方法。方法選用出生后24h內(nèi)的SD大鼠，分離大鼠大腦皮質細胞，加入含體積分數(shù)10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，于倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長形態(tài);取傳代培養(yǎng)的第3代細胞，采用計數(shù)板計數(shù)法和四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測細胞生長情況。結果從新生大鼠大腦皮質分離的細胞生長旺盛，星形膠質細胞形態(tài)典型，未見其他種類細胞生長。結論建立了一種簡單易行的大鼠星形膠質細胞體外培養(yǎng)方法。【關鍵詞】星形膠質細胞/病理學細胞培養(yǎng)體外的大鼠星形膠質細胞功能廣泛，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、突

2、觸傳遞、神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和新陳代謝等中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種正常生理活動.freelga公司);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。23232型CO2恒溫培養(yǎng)箱(SheldonManufactruing.Inc，USA);3k15低溫離心機(美國Sigma公司);DLCJIF超凈工作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司);MPS60倒置顯微鏡(LeikaDMIRB);超純水系統(tǒng)(MILLPORE，SAS67120MOISHEMA，F(xiàn)rance);佳能A630數(shù)碼相機;550型酶標儀(BIORAD公司)。1.3星形膠質細胞的原代培養(yǎng)取新生SD大鼠(生后24h內(nèi))，斷頸處死后浸入體積分數(shù)75

3、%乙醇中消毒。以血管鉗從后夾住頸部，用眼科剪從枕部向前依次分開頭皮及顱骨，再用眼科鑷依次剝離，剔除腦膜及血管。取大腦(剔除海馬部分)置于DHanks液中，用鑷子撕碎成糜狀，眼科剪反復剪10min，用移液槍輕輕吹打20～30次，用1.25g/L的胰蛋白酶消化15min，然后以含體積分數(shù)10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基終止消化，1000r/min離心10min去上清后重新加入含血清培養(yǎng)基，吹打均勻，將細胞懸液接種至底壁面積為25cm2的培養(yǎng)瓶中，接種密度為1×106個/cm2，置培養(yǎng)箱中，37℃、體積分數(shù)5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，第2天待細胞貼壁后換液1次并去除死細胞，以后

4、每2～3d換液1次，細胞長成致密單層后進行傳代培養(yǎng)。1.4傳代培養(yǎng)細胞生長了8～10d后,在顯微鏡下可見細胞長滿瓶底90%。向每個培養(yǎng)瓶中加入1.25g/L的胰蛋白酶1mL消化3～4min，消化時在顯微鏡下密切觀察,防止消化過度導致細胞死亡。待細胞脫壁后,用含體積分數(shù)10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基終止消化。將細胞懸液移入10mL離心管中,以1000r/min離心10min去上清后重新加入含血清培養(yǎng)基，吹打均勻，將細胞懸液接種至底壁面積為25cm2的培養(yǎng)瓶中，接種密度為1×106個/cm2，置培養(yǎng)箱中，37℃、體積分數(shù)5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng),每2～3d換液1次，待細胞長滿

5、瓶底90%以上時再次進行傳代培養(yǎng)。1.5細胞生長情況1.5.1計數(shù)板計數(shù)將血球計數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上。吸出少許細胞懸液，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間，靜置3min。鏡下觀察，計算計數(shù)板4大格細胞總數(shù)，壓線細胞只計左側和上方的。然后按公式計算：n細胞(個·mL-1)=n細胞總數(shù)/4×10000。鏡下偶見由2個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計算，若細胞團占10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液。1.5.2四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法取培養(yǎng)第3代細胞，制成單細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，103～104/孔，每塊板接種10孔，一共接種6塊96孔

6、培養(yǎng)板，每孔培養(yǎng)基總量200μL，37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);分別于第1、2、3、5、7天加入2mg/mL的MTT液(50μL/孔),繼續(xù)培養(yǎng)3h，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入二甲基亞砜(DMSO)液150μL/孔，將培養(yǎng)板置于微孔板振蕩器上振蕩10min，使結晶物溶解，酶標儀檢測各孔吸光度(D)值(檢測波長490nm)。記錄結果，繪制細胞生長曲線。2結果2.1細胞形態(tài)倒置相差顯微鏡下活體觀察見星形膠質細胞的分離純化過程中細胞生長情況與國外文獻報道一致4-5，星形膠質細胞生長良好，細胞貼壁后開始生長繁殖，胞體不斷增大，突觸不斷增多，并且細胞之間形成廣泛的聯(lián)系。原代分離的大鼠

7、大腦皮層細胞在種植24h后，所有細胞均已貼壁，光暈明顯。培養(yǎng)3～4d后，細胞數(shù)量增多。隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)物中的星形膠質細胞的比例越來越大，而神經(jīng)元、少突膠質細胞的比例越來越少。傳代后的細胞貼壁更快，一般6h左右大部分貼壁，第2天可以看到細胞開始鋪開生長(圖1-a)，第3天細胞突起明顯，第5天細胞突觸相互接觸，細胞生長呈倍數(shù)增長，細胞數(shù)量和體積增大，細胞之間有廣泛的接觸(圖1-b、c)，第7～8天細胞生長達到高峰(圖-d)，以后細胞生長在形態(tài)和數(shù)量上變化不大。3討論星形膠質細