新生大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)論文

新生大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)論文

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1、新生大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)論文謝裕華易春智項(xiàng)曉偉劉建仁【摘要】目的建立新生大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法。方法選用出生后24h內(nèi)的SD大鼠,分離大鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞,加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài);取傳代培養(yǎng)的第3代細(xì)胞,采用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法和四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況。結(jié)果從新生大鼠大腦皮質(zhì)分離的細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛,星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)典型,未見(jiàn)其他種類(lèi)細(xì)胞生長(zhǎng)。結(jié)論建立了一種簡(jiǎn)單易行的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)方法?!娟P(guān)鍵詞】星形膠質(zhì)細(xì)胞/病理學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)體外的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞功能廣泛,在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、突

2、觸傳遞、神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和新陳代謝等中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種正常生理活動(dòng).freelga公司);其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。23232型CO2恒溫培養(yǎng)箱(SheldonManufactruing.Inc,USA);3k15低溫離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司);DLCJIF超凈工作臺(tái)(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司);MPS60倒置顯微鏡(LeikaDMIRB);超純水系統(tǒng)(MILLPORE,SAS67120MOISHEMA,F(xiàn)rance);佳能A630數(shù)碼相機(jī);550型酶標(biāo)儀(BIORAD公司)。1.3星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)取新生SD大鼠(生后24h內(nèi)),斷頸處死后浸入體積分?jǐn)?shù)75

3、%乙醇中消毒。以血管鉗從后夾住頸部,用眼科剪從枕部向前依次分開(kāi)頭皮及顱骨,再用眼科鑷依次剝離,剔除腦膜及血管。取大腦(剔除海馬部分)置于DHanks液中,用鑷子撕碎成糜狀,眼科剪反復(fù)剪10min,用移液槍輕輕吹打20~30次,用1.25g/L的胰蛋白酶消化15min,然后以含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基終止消化,1000r/min離心10min去上清后重新加入含血清培養(yǎng)基,吹打均勻,將細(xì)胞懸液接種至底壁面積為25cm2的培養(yǎng)瓶中,接種密度為1×106個(gè)/cm2,置培養(yǎng)箱中,37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng),第2天待細(xì)胞貼壁后換液1次并去除死細(xì)胞,以后

4、每2~3d換液1次,細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。1.4傳代培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)了8~10d后,在顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底90%。向每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入1.25g/L的胰蛋白酶1mL消化3~4min,消化時(shí)在顯微鏡下密切觀察,防止消化過(guò)度導(dǎo)致細(xì)胞死亡。待細(xì)胞脫壁后,用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞懸液移入10mL離心管中,以1000r/min離心10min去上清后重新加入含血清培養(yǎng)基,吹打均勻,將細(xì)胞懸液接種至底壁面積為25cm2的培養(yǎng)瓶中,接種密度為1×106個(gè)/cm2,置培養(yǎng)箱中,37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng),每2~3d換液1次,待細(xì)胞長(zhǎng)滿

5、瓶底90%以上時(shí)再次進(jìn)行傳代培養(yǎng)。1.5細(xì)胞生長(zhǎng)情況1.5.1計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)將血球計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈,并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。吸出少許細(xì)胞懸液,滴加在蓋片邊緣,使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間,靜置3min。鏡下觀察,計(jì)算計(jì)數(shù)板4大格細(xì)胞總數(shù),壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按公式計(jì)算:n細(xì)胞(個(gè)·mL-1)=n細(xì)胞總數(shù)/4×10000。鏡下偶見(jiàn)由2個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán),應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算,若細(xì)胞團(tuán)占10%以上,說(shuō)明分散不好,需重新制備細(xì)胞懸液。1.5.2四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法取培養(yǎng)第3代細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板,103~104/孔,每塊板接種10孔,一共接種6塊96孔

6、培養(yǎng)板,每孔培養(yǎng)基總量200μL,37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);分別于第1、2、3、5、7天加入2mg/mL的MTT液(50μL/孔),繼續(xù)培養(yǎng)3h,吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后,加入二甲基亞砜(DMSO)液150μL/孔,將培養(yǎng)板置于微孔板振蕩器上振蕩10min,使結(jié)晶物溶解,酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度(D)值(檢測(cè)波長(zhǎng)490nm)。記錄結(jié)果,繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。2結(jié)果2.1細(xì)胞形態(tài)倒置相差顯微鏡下活體觀察見(jiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的分離純化過(guò)程中細(xì)胞生長(zhǎng)情況與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道一致4-5,星形膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)良好,細(xì)胞貼壁后開(kāi)始生長(zhǎng)繁殖,胞體不斷增大,突觸不斷增多,并且細(xì)胞之間形成廣泛的聯(lián)系。原代分離的大鼠

7、大腦皮層細(xì)胞在種植24h后,所有細(xì)胞均已貼壁,光暈明顯。培養(yǎng)3~4d后,細(xì)胞數(shù)量增多。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),培養(yǎng)物中的星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例越來(lái)越大,而神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞的比例越來(lái)越少。傳代后的細(xì)胞貼壁更快,一般6h左右大部分貼壁,第2天可以看到細(xì)胞開(kāi)始鋪開(kāi)生長(zhǎng)(圖1-a),第3天細(xì)胞突起明顯,第5天細(xì)胞突觸相互接觸,細(xì)胞生長(zhǎng)呈倍數(shù)增長(zhǎng),細(xì)胞數(shù)量和體積增大,細(xì)胞之間有廣泛的接觸(圖1-b、c),第7~8天細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到高峰(圖-d),以后細(xì)胞生長(zhǎng)在形態(tài)和數(shù)量上變化不大。3討論星形膠質(zhì)細(xì)

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