豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬瘟病毒混合感染的診斷與防制分析

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1、豬繁殖與呼吸綜合征、圓環(huán)病毒2型和豬瘟病毒的混合感染的診斷與防制分析夏偉1、2李鵬1危艷武3張宇輝2羅玉均2馮春復21、黑龍江八一農(nóng)墾大學黑龍江大慶1633192、哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司黑龍江哈爾濱1500013、中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所豬傳染病研究室哈爾濱150001摘要:2011年12月，南方某大型豬場爆發(fā)以母豬流產(chǎn)，死胎，弱仔，哺乳期仔豬發(fā)生體溫升高，皮膚發(fā)紺，呼吸衰竭，頑固性腹瀉；保育仔豬發(fā)燒，聚堆，皮膚紅，昏睡，腹股溝淋巴結(jié)腫大為主要癥狀的疾病，死淘率高。剖殺3頭發(fā)病哺乳仔豬，3頭死亡保育豬取淋巴結(jié)、脾、肺臟病變組織用PC

2、R，RT-PCR方法分別檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒，圓環(huán)病毒2型，豬瘟野毒為陽性，結(jié)合本病的臨床癥狀和病理剖檢確診為豬繁殖與呼吸綜合征，圓環(huán)病毒2型，豬瘟的混合感染。關(guān)鍵詞:豬繁殖與呼吸綜合征病毒；圓環(huán)病毒2型；豬瘟病毒；混合感染；診斷豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是世界范圍內(nèi)一種重要的豬傳染病,1996年哈爾濱獸醫(yī)研究所郭寶清首次證實我國有PRRS存在[1]，并從繁殖障礙豬群分離到PRRSV[2]。近幾年對我國發(fā)病豬群的血清檢測結(jié)果表明，該病現(xiàn)已存在于我國大部分地區(qū)[3]，并且呈暴發(fā)式流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的經(jīng)濟損失。特別自2006年“豬

3、高熱病”流行后，據(jù)有關(guān)研究表明，豬繁殖與呼吸綜合征變異毒株是由普通豬繁殖與呼吸綜合征病毒的NSP2段基因發(fā)生了缺失變異而來，其臨床癥狀主要是出現(xiàn)“三高一低”即高熱（40℃以上）、高發(fā)病率、高死亡率、低治愈率；豬群出現(xiàn)皮膚發(fā)紅，個別有神經(jīng)癥狀，能導致母豬流產(chǎn)甚至死亡，給養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展帶來重創(chuàng)。豬圓環(huán)病毒2型（PCV2)感染已經(jīng)是威脅當前世界養(yǎng)豬業(yè)的一個重要疾病，1991年P(guān)MWS首次在加拿大被發(fā)現(xiàn)，目前已證實呈世界性流行。PCV2感染引起的相關(guān)疾病在我國的流行情況也十分嚴重，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[4,5]。我國學者在我國許多地方都分離出了這

4、種病毒,且和其他病毒混合感染的情況日益明顯，PCV-2感染病例在臨床上經(jīng)?？梢姟Ｘi瘟(CSF)是由豬瘟病毒(CSFV)引起的一種高致死性、烈性傳染病。近幾年隨著我國規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展,豬瘟的發(fā)生出現(xiàn)一些新特點,表現(xiàn)為發(fā)病年齡小、散發(fā)流行、混合感染以及非典型性或隱性等特點[6]，這又給本病的防治帶來了很大的困難。生產(chǎn)實踐中，PRRSV、PCV-2混合感染[7]，PRRSV、CSFV混合感染[8]，CSFV、PCV2混合感染[9]最為常見。本試驗應用PCR，RT-CR方法結(jié)合臨床癥狀和病理剖檢對上海某豬場豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV），圓環(huán)

5、病毒Ⅱ型（PCV2)，豬瘟病毒（CSFV）混合感染進行了確診,從而為豬場防制本病，制定合理的免疫程序提供科學依據(jù)。1材料與方法1.1　病料來源　來自上海某豬場的6份發(fā)病豬和死亡豬的肺臟、脾臟、淋巴結(jié)等臟器，編號，3、4、5號為哺乳仔豬，6、7、8號為保育仔豬。冷凍運送，-20℃保存?zhèn)溆谩?.2酶和其他試劑　PCR擴增試劑盒、飽和酚、TaqDNA聚合酶、dNTPs、EB、DEPC、提取總RNA用TRIzol,BioFlux公司產(chǎn)品，Cycle-PureKit,OMEGA公司產(chǎn)品。DL2000Marker，TaKaRaRNAPCRKit(AMV)

6、Ver.3.0購自大連寶生物有限責任公司；其他試劑均為分析純試劑。1.3　引物設(shè)計及合成根據(jù)GenBank上發(fā)表的PRRSV基因序列(AY032626;AY262352),用Oli-go6.0軟件設(shè)計引物，上游引物5′-AGAACTGTGACAACAACGCTG-3′，下游引物：5′-GAGTCGATGATGGCTTGAGCT-3′，擴增缺失株（高致病性PRRSV毒株）和非缺失株（經(jīng)典PRRSV毒株）預期擴增產(chǎn)物長度分別約263bp和350bp。由寶生物工程(大連)有限公司合成。根據(jù)已發(fā)表的PCV-2核酸全序列合成了1對特異性的PCR引物。上

7、游引物:5′-CAGCAAGAAGAATGGAAGAAGCGGA-3′:下游引物:5′-CCAGGACTACAATATCCGTGTAACT-3′。擴增目的基因片段長為1057bp，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。參考GenBank中公布的豬瘟病毒（CSFV），石門（shimen）株基因組，設(shè)計合成了1對CSFV特異性的引物Csfv-F：5ˊ-AAGTAACAGAGACATGAATGG-3ˊCsfv-R：5ˊ-CCAAAAGGATAGGTAGGGT-3ˊ由寶生物工程(大連)有限公司合成。1.4　病料處理及DNA的提取將組織樣品稱量、研磨，

8、制成勻漿后反復凍融3次，取上清液按照常規(guī)方法提取樣品總DNA參照文獻[10]1.5　RNA的提取及cDNA合成參照文獻[11]1.6　PRRSV—RT-PCR反應