體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向子宮韌帶成纖維細(xì)胞分化的研究

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1、博士學(xué)位論文體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向子宮韌帶成纖維細(xì)胞分化的研究作者姓名：趙冰導(dǎo)師姓名：張曦教授崔世紅教授學(xué)科門類：醫(yī)學(xué)專業(yè)名稱：婦產(chǎn)科學(xué)完成時(shí)間：2012年3月AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofdoctorAResearchontheIn-VitroInductionofRatBoneMarrowMesenchymalStemCellsintoUterineLligamentsFibroblastsBy:BingZhaoSupervisor:Prof.Xi

2、Zhang;Prof.ShihongCuiGynecologyandObstetricsTheThirdAffiliatedHospitalofZhengZhouUniversityMarch2012摘耍體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向子宮韌帶成纖維細(xì)胞分化的研究研究生：趙冰導(dǎo)師：張曦教授崔世紅教授專業(yè)：婦產(chǎn)科學(xué)鄭州大學(xué)第三臨床學(xué)院河南鄭州450052摘要研究背景人體盆底組織主要起承載人體盆腔各臟器的作用，女性盆底組織主要包括封閉骨盆出口的多層肌肉、筋膜及子宮韌帶。這些組織因各種原因（如：妊娠、分娩、便秘、長(zhǎng)期咳嗽等）發(fā)生損傷或撕裂

3、而使其支持功能減弱時(shí)，即發(fā)生子宮及相鄰的直腸、膀胱、陰道壁發(fā)生移位及功能障礙，臨床上稱之為盆底功能障礙疾病（pelvicfloordysunction,PFD)，主要指壓力性尿失禁(stressurinaryincontinence,SUI)和盆腔臟器脫垂（pelvicorgenprolapse,POP)。目前治療方法主要包括手術(shù)治療和保守性的藥物治療及盆底肌肉鍛煉等康復(fù)治療，但這些治療均有其不足之處。特別是韌帶組織，損傷后其修復(fù)過程形成瘢痕組織，不是真正意義上的再生，同時(shí)對(duì)盆底起最主要支持力量的子宮宮骶韌帶-主韌帶復(fù)合體的結(jié)構(gòu)功

4、能又與PFD的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。因此，如何使損傷后的子宮韌帶恢復(fù)其正常的結(jié)構(gòu)和功能，是真IH治療該疾病急需解決的問題。組織工程學(xué)的誕生，為子宮韌帶的修復(fù)提供了新的手段。最近的研究表明：在修復(fù)過程中，受損韌帶局部出現(xiàn)來源于骨髓間充質(zhì)的干細(xì)胞，其性狀與周圍的韌帶成纖維細(xì)胞非常相似。在受損膝腱、髕韌帶中注射入含骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞或成纖維細(xì)胞的纖連蛋白基質(zhì)可影響其組織學(xué)形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)和必需的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白mRNA的表達(dá)，使受損膝腱、韌帶更容易恢復(fù)。另外發(fā)現(xiàn)，骨髓間I摘耍充質(zhì)干細(xì)胞與肌腱或韌帶成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)后可提高兔肌腱、韌帶相關(guān)基因的表

5、達(dá)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)是一種具有自我復(fù)制和多向分化潛能的原始細(xì)胞，在體內(nèi)、外均可定向誘導(dǎo)分化為具有各種表型的子代細(xì)胞。本研究旨在研究體外正常細(xì)胞及機(jī)械牽張損傷細(xì)胞在共培養(yǎng)體系中定向誘導(dǎo)BMSCs分化為子宮韌帶成纖維細(xì)胞的影響。實(shí)驗(yàn)中用機(jī)械牽張刺激損傷體外培養(yǎng)的大鼠子宮韌帶成纖維細(xì)胞，造成PFD的細(xì)胞損傷模型，將BMSCs與.TH常子宮韌帶成纖維細(xì)胞和機(jī)械牽張損傷的子宮韌帶成纖維細(xì)胞在體外間接共培養(yǎng)（非接觸式）。同時(shí)，檢測(cè)共培養(yǎng)誘導(dǎo)后BMSCs彈性蛋白、賴氨酰

6、氧化酶(lysyloxidase,LOX)、Fibulin-5的表達(dá)情況，以進(jìn)一歩認(rèn)i只BMSCs的分化潛能及生物學(xué)特性。本文研究了在體外通過非接觸式共培養(yǎng)誘導(dǎo)BMSCs向子宮韌帶成纖維細(xì)胞的分化，為從組織工程學(xué)角度以根源上治療PFD疾病提供可能的研究思路及新的治療手段。研究方法1.大鼠BMSCs的體外分離培養(yǎng)：采用密度梯度離心法結(jié)合傳代貼壁篩選法分離純化獲得大鼠BMSCs;通過形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制、細(xì)胞表面特異抗原及細(xì)胞周期的流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，對(duì)體外培養(yǎng)獲得的BMSCs進(jìn)行初歩鑒定；采用體外誘導(dǎo)大鼠BMSCs向成骨細(xì)胞和

7、成脂細(xì)胞的分化，對(duì)獲得的BMSCs的生物學(xué)功能進(jìn)行鑒定。2.大鼠子宮韌帶成纖維細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)及鑒定：采用大鼠子宮韌帶組織塊酶消化法，進(jìn)行子宮韌帶成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)，通過形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制及免疫組化測(cè)定其膠原i、m蛋白的表達(dá)對(duì)獲得的子宮軔帶成纖維細(xì)胞迸行鑒定。3.對(duì)大鼠子宮韌帶成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外機(jī)械牽張，建立機(jī)械牽張損傷模型：根據(jù)韌帶成纖維細(xì)胞的生物學(xué)特性，在細(xì)胞牽張儀上采用負(fù)載10%應(yīng)力，1赫茲的機(jī)械牽張刺激大鼠子宮韌帶成纖維細(xì)胞3h、6h、12h、24h,36h不同時(shí)間段后，通過透射電鏡、鬼筆環(huán)肽染色觀察不

8、同吋問牽張損傷后成纖維細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞骨架的變化情況；采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)測(cè)定不同吋問牽張損傷后成纖維細(xì)胞1型膠原和III型膠原的合成能力；用臺(tái)盼藍(lán)染色觀察細(xì)胞的凋II摘耍亡情況。4.大鼠BMSCs與大鼠子宮韌帶成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)體系