體外誘導大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向子宮韌帶成纖維細胞分化的研究

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1、博士學位論文體外誘導大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向子宮韌帶成纖維細胞分化的研究作者姓名：趙冰導師姓名：張曦教授崔世紅教授學科門類：醫(yī)學專業(yè)名稱：婦產(chǎn)科學完成時間：2012年3月AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofdoctorAResearchontheIn-VitroInductionofRatBoneMarrowMesenchymalStemCellsintoUterineLligamentsFibroblastsBy:BingZhaoSupervisor:Prof.Xi

2、Zhang;Prof.ShihongCuiGynecologyandObstetricsTheThirdAffiliatedHospitalofZhengZhouUniversityMarch2012摘耍體外誘導大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向子宮韌帶成纖維細胞分化的研究研究生：趙冰導師：張曦教授崔世紅教授專業(yè)：婦產(chǎn)科學鄭州大學第三臨床學院河南鄭州450052摘要研究背景人體盆底組織主要起承載人體盆腔各臟器的作用，女性盆底組織主要包括封閉骨盆出口的多層肌肉、筋膜及子宮韌帶。這些組織因各種原因（如：妊娠、分娩、便秘、長期咳嗽等）發(fā)生損傷或撕裂

3、而使其支持功能減弱時，即發(fā)生子宮及相鄰的直腸、膀胱、陰道壁發(fā)生移位及功能障礙，臨床上稱之為盆底功能障礙疾?。╬elvicfloordysunction,PFD)，主要指壓力性尿失禁(stressurinaryincontinence,SUI)和盆腔臟器脫垂（pelvicorgenprolapse,POP)。目前治療方法主要包括手術(shù)治療和保守性的藥物治療及盆底肌肉鍛煉等康復治療，但這些治療均有其不足之處。特別是韌帶組織，損傷后其修復過程形成瘢痕組織，不是真正意義上的再生，同時對盆底起最主要支持力量的子宮宮骶韌帶-主韌帶復合體的結(jié)構(gòu)功

4、能又與PFD的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。因此，如何使損傷后的子宮韌帶恢復其正常的結(jié)構(gòu)和功能，是真IH治療該疾病急需解決的問題。組織工程學的誕生，為子宮韌帶的修復提供了新的手段。最近的研究表明：在修復過程中，受損韌帶局部出現(xiàn)來源于骨髓間充質(zhì)的干細胞，其性狀與周圍的韌帶成纖維細胞非常相似。在受損膝腱、髕韌帶中注射入含骨髓問充質(zhì)干細胞或成纖維細胞的纖連蛋白基質(zhì)可影響其組織學形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)和必需的細胞外基質(zhì)蛋白mRNA的表達，使受損膝腱、韌帶更容易恢復。另外發(fā)現(xiàn)，骨髓間I摘耍充質(zhì)干細胞與肌腱或韌帶成纖維細胞共培養(yǎng)后可提高兔肌腱、韌帶相關(guān)基因的表

5、達。骨髓間充質(zhì)干細胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)是一種具有自我復制和多向分化潛能的原始細胞，在體內(nèi)、外均可定向誘導分化為具有各種表型的子代細胞。本研究旨在研究體外正常細胞及機械牽張損傷細胞在共培養(yǎng)體系中定向誘導BMSCs分化為子宮韌帶成纖維細胞的影響。實驗中用機械牽張刺激損傷體外培養(yǎng)的大鼠子宮韌帶成纖維細胞，造成PFD的細胞損傷模型，將BMSCs與.TH常子宮韌帶成纖維細胞和機械牽張損傷的子宮韌帶成纖維細胞在體外間接共培養(yǎng)（非接觸式）。同時，檢測共培養(yǎng)誘導后BMSCs彈性蛋白、賴氨酰

6、氧化酶(lysyloxidase,LOX)、Fibulin-5的表達情況，以進一歩認i只BMSCs的分化潛能及生物學特性。本文研究了在體外通過非接觸式共培養(yǎng)誘導BMSCs向子宮韌帶成纖維細胞的分化，為從組織工程學角度以根源上治療PFD疾病提供可能的研究思路及新的治療手段。研究方法1.大鼠BMSCs的體外分離培養(yǎng)：采用密度梯度離心法結(jié)合傳代貼壁篩選法分離純化獲得大鼠BMSCs;通過形態(tài)學觀察、細胞生長曲線繪制、細胞表面特異抗原及細胞周期的流式細胞學檢測，對體外培養(yǎng)獲得的BMSCs進行初歩鑒定；采用體外誘導大鼠BMSCs向成骨細胞和

7、成脂細胞的分化，對獲得的BMSCs的生物學功能進行鑒定。2.大鼠子宮韌帶成纖維細胞的體外分離培養(yǎng)及鑒定：采用大鼠子宮韌帶組織塊酶消化法，進行子宮韌帶成纖維細胞的原代培養(yǎng)，通過形態(tài)學觀察、細胞生長曲線的繪制及免疫組化測定其膠原i、m蛋白的表達對獲得的子宮軔帶成纖維細胞迸行鑒定。3.對大鼠子宮韌帶成纖維細胞進行體外機械牽張，建立機械牽張損傷模型：根據(jù)韌帶成纖維細胞的生物學特性，在細胞牽張儀上采用負載10%應(yīng)力，1赫茲的機械牽張刺激大鼠子宮韌帶成纖維細胞3h、6h、12h、24h,36h不同時間段后，通過透射電鏡、鬼筆環(huán)肽染色觀察不

8、同吋問牽張損傷后成纖維細胞的超微結(jié)構(gòu)和細胞骨架的變化情況；采用實時定量RT-PCR技術(shù)測定不同吋問牽張損傷后成纖維細胞1型膠原和III型膠原的合成能力；用臺盼藍染色觀察細胞的凋II摘耍亡情況。4.大鼠BMSCs與大鼠子宮韌帶成纖維細胞共培養(yǎng)體系