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《腸道病毒71型p1蛋白鼠源性單克隆抗體的鑒定及腸道病毒71型快速vp1--elisa中和實(shí)驗(yàn)的建立》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、南方醫(yī)科大學(xué)2011級(jí)碩士學(xué)位論文腸道病毒71型P1蛋白鼠源性單克隆抗體的鑒定及腸道病毒71型快速VPl．ELISA中和實(shí)驗(yàn)的建立IdentificationofapanelofMurineMonocionalAntibodiesagainstP1ProteinofEnterovirus71&DevelopmentofaVPl一ELISAAssayforRapidDetectionofNeutralizingAntibodiesagainstEnterovirus71課題來(lái)源：國(guó)家自然基金青年項(xiàng)目“
2、腸道病毒EV71及CoxAl6P1蛋白免疫原性及抗原表位分析”(編號(hào)：8102287)學(xué)位申請(qǐng)人唐培導(dǎo)師姓名專業(yè)名稱培養(yǎng)類型培養(yǎng)層次所在學(xué)院答辯委主席答辯委成員吳玉章車小燕臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)專業(yè)型碩士研究生第二臨床醫(yī)學(xué)院曾其毅富寧江麗芳裘宇容溫旺榮2014年5月23日廣州碩士學(xué)位論文腸道病毒71型P1蛋白鼠源性單克隆抗體的鑒定及腸道病毒71型快速VPl一ELISA中和實(shí)驗(yàn)的建立碩士研究生：唐培指導(dǎo)教師：吳玉章教授車小燕研究員摘要手足口病(hand，foot，andmouthdisease，HFMD)是一
3、種以發(fā)熱及手、足、口腔等部位出現(xiàn)皰疹為主要的臨床特征的兒童常見(jiàn)傳染病。絕大部分兒童感染后的病情較輕，但少部分患兒會(huì)出現(xiàn)比較嚴(yán)重的神經(jīng)、呼吸和循環(huán)系統(tǒng)的并發(fā)癥，甚至死亡。近幾十年在亞太地區(qū)頻繁暴發(fā)高致病性和高死亡率的手足口病疫情，已成為嚴(yán)重威脅兒童健康的一種疾病。研究表明近幾十年引起手足口病疫情的主要病原是腸道病毒71型(Enterovirus71，EV71)及柯薩奇A16病毒(CoxsachievirusA16，CoxAl6)，由于EV71具有中樞神經(jīng)親嗜性，部分EV71感染患者會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥
4、(無(wú)菌性腦膜炎、腦干腦炎、神經(jīng)源性肺水腫等)以及全身性并發(fā)癥(多器官衰竭、休克、DIC等)，是手足口病的主要致死原因，因而EV71成為科學(xué)家研究的熱點(diǎn)。EV71屬小核糖核酸病毒科，病毒由四種衣殼蛋白(VPl—VP4)組成的衣殼包裹RNA核心所構(gòu)成。VPl、VP2和VP3衣殼蛋白位于病毒衣殼的外表面，因而病毒的中和表位主要位于這三個(gè)蛋白上。VP4蛋白位于病毒表面內(nèi)側(cè)，可能與維持病毒結(jié)構(gòu)有關(guān)，尚無(wú)中和表位發(fā)現(xiàn)。由于VPl和VP4基因相對(duì)保守，目前按VPl和(或)VP4基因?qū)V71病毒進(jìn)行分型，分A、B
5、1一B5、C1．C5，共11個(gè)基因亞型，中國(guó)大陸自1997年后只有C4亞型流行。目前針對(duì)腸道病毒EV71感染尚無(wú)有效的預(yù)防治療藥物，因而尋求預(yù)防和治T摘要療EV71感染的藥物和研制EV71疫苗正成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者共同關(guān)注的課題。臨床研究表明給予患者輸注免疫球蛋白可以改善病情。但是輸注免疫球蛋白存在感染血液傳染病的風(fēng)險(xiǎn)，并且商品化的免疫球蛋白很難保障批次間質(zhì)量的一致性。使用高中和活性的單抗可以避免這些問(wèn)題。因而制備高中和活性的EV71單抗可以為EV71治療提供新的思路。由于EV71感染所致的重癥手足口病會(huì)
6、留下后遺癥，所以開(kāi)發(fā)EV71疫苗是目前控制EV71疫情，減少疾病死亡率、致殘率的最佳策略。誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生的能力是評(píng)價(jià)疫苗的效果的重要指標(biāo)。目前在EV71研究中公認(rèn)的中和實(shí)驗(yàn)方法是基于細(xì)胞病變的中和實(shí)驗(yàn)(cytopathiceffectbasedmicroneutralizationtest，CPE．MNT)，這種方法存在耗時(shí)耗力，結(jié)果不夠客觀等缺陷，不適合用于大批量檢測(cè)。因而亟需建立簡(jiǎn)便、快速、客觀的適合高通量檢測(cè)的新方法。前期我們實(shí)驗(yàn)室以EV71病毒(C4亞型)和重組VP4蛋白為抗原免疫小鼠，
7、通過(guò)雜交瘤細(xì)胞法制備了一批針對(duì)EV71的抗體。為進(jìn)一步明確這些單抗所針對(duì)的靶標(biāo)，采用酵母展示技術(shù)構(gòu)建了分別表達(dá)VPl、VP2、VP3和VP4蛋白的重組酵母，鑒定出一組針對(duì)EV71衣殼蛋白的單抗；利用經(jīng)典中和實(shí)驗(yàn)篩選出具有中和活性的EV71單克隆抗體；另外我們建立了一種基于ELISA檢測(cè)的簡(jiǎn)便、快速、客觀的高通量的EV71中和實(shí)驗(yàn)方法。進(jìn)而為研究Ev71病毒衣殼的抗原結(jié)構(gòu)及功能以及疫苗制備提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究?jī)?nèi)容包含三個(gè)部分：第一部分：百荸母展示技術(shù)表達(dá)EV71的四種衣殼蛋白酵母表面展示技術(shù)以其較為完善
8、的蛋白質(zhì)翻譯后修飾和分泌機(jī)制、安全無(wú)毒等獨(dú)特的優(yōu)越性，近年來(lái)頗受關(guān)注，已成為蛋白質(zhì)工程研究的功能平臺(tái)。本研究應(yīng)用pYDlEBYl00酵母展示系統(tǒng)將EV71的VPl、VP2、VP3和VP4四種衣殼蛋白展示在EBYl00釀酒酵母表面：根據(jù)EV71(GZR)基因序列信息設(shè)計(jì)引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得VPl、VP2、VP3和VP4基因片段，利用雙酶切和連接將目的片段定向插入到pYDl質(zhì)粒中，構(gòu)建了重組的VPl—pYDl、VP2．pYDl、II碩士學(xué)位論文VP3．pYDl和VP4．
