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《ev71型腸道病毒抗體的制備和鑒定》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、摘要腸道病毒71型(Enterovirustype71，EV71)是小型RNA病毒科腸道病毒屬成員，其感染性強、致病率高，是導(dǎo)致手足口病的主要病原，同時能引起多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病。由于腸道病毒屬成員數(shù)量多、結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性相似，導(dǎo)致其臨床診斷和分類鑒定難度加大。目前針對腸道病毒71型感染多采用抗生素進行治療，但是在當(dāng)前病毒耐藥性不斷增加的情況下，尋找一種更安全、更高效的治療特效藥及診斷方法成為一個急需解決的問題。本論文實驗：(1)制備特異性抗腸道病毒71型卵黃抗體，然后通過SDS—PAGE凝膠電泳、考馬斯亮藍染色法、酶聯(lián)免疫吸附試驗、免疫雙向瓊脂擴散、Westernblo
2、t、體外病毒中和實驗等方法對其生物活性進行鑒定；(2)通過建立陽性雜交瘤細胞株及體內(nèi)誘生腹水法制備了大量抗腸道病毒7l型VPI蛋白單克隆抗體，辛酸硫酸銨沉淀法純化后通過SDS-PAGE電泳和紫外分光光度法鑒定抗體純度和含量，間接ELISA法測定其中和效價，鼠單抗業(yè)型分型試紙鑒定其Ig類與亞類；(3)利用偶聯(lián)劑EDC和Sulfo-NHS將腸道病毒7l型VPI蛋白單克隆抗體偶聯(lián)到聚丙烯酸修飾的水溶性核量子點上，并利用酶聯(lián)免疫法、熒光發(fā)射光譜、高性能生物質(zhì)譜等分析方法對偶聯(lián)物進行分析i·在此基礎(chǔ)上應(yīng)用卵黃抗體為捕獲抗體，量子點標記的單克隆抗體作為檢測抗體，建立了量子點標記免疫熒光檢
3、測EV71病毒的標準曲線。實驗結(jié)果：(1)考馬斯亮藍染色法測得卵黃中IgY得率達7．76mg／mL，SDS—PAGE凝膠電泳測得IgY抗體的純度為94．86％。初免lOd后蛋黃中可檢測到特異性抗EV71IgY抗體，初免40天后ELISA檢測抗體效價達最高1：20480，雙向瓊脂擴散檢測效價達1：16。Westernblot分析提取的IgY抗體具有良好的免疫反應(yīng)性，能與EV71特異性結(jié)合；同時制備的特異性抗EV71IgY具有良好的體外中和活性，最低中和溶度為7．9ug／mL，中和效價為l：128。(2)初步篩選到2株抗腸道病毒71型VPI蛋白的細胞株，效價均達到了106以上；腹
4、水純化后經(jīng)還原性SDS—PAGE電泳可見兩條清晰的IgG重輕鏈，紫外分光光度法測純化前后蛋白濃度分別為為39．28mg／mL和5．6mg／mL。經(jīng)鼠單抗業(yè)型分型試紙鑒定獲得的單抗類型為IgG2b類，輕鏈為K鏈。(3)由酶聯(lián)免疫法及紫外透射反射觀察結(jié)果可知QDS-MAb同時擁有MAb的生物活性及QDS的化學(xué)發(fā)光特性。熒光光潛圖中QDS-MAb熒光最大發(fā)射波長紅移4nm及質(zhì)譜圖中QDS—MAb的分子離廣東工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文子峰比MAb分子離子峰增大了2973這些結(jié)果都證實抗腸道病毒71型VPl單克隆抗體蛋白成功偶聯(lián)到水溶性量子點上，且結(jié)構(gòu)未受破壞。通過棋盤滴定法確定了量子點熒光
5、免疫檢測EV71法中卵黃抗體最佳包被溶度為4ng／mL，病毒檢測標準曲線方程為y=301．66x+3307，R2=0．991l，檢測范圍為1．953x10。3ug／mL至0．03125ug／mL。關(guān)鍵詞：腸道病毒71型；單克隆抗體；卵黃抗體：制備；鑒定；病毒檢測¨ABSTRACTABSTRACTEnterovirus71belongstothehumanenterovirusfamilyofPicomaviridae，hasstronginfectionandhighpathogenicrate．EV71isthemainagentsofHFMD，alsocancauseav
6、arietyofnervoussystemrelateddisease．Becausenumberofintestinalvirushavesimilarstructureandbiologicalcharacteristics，SOitisdifficultiestodiagnosisandidentificationtheev71inclinical．Currently,antibioticsaremostlyusedtotreatdiseasescausedbyEV71，Butthedrugresistanceofvirusaregrowing．Soitisurgent
7、tosearchforasaferandmoreefficienttreatmentanddiagnosismethodsspecificforEV71．Experiments(1)Topreparespecificitychickeneggyolkantibodyagainstenterovirus71，thendetectingitsbiologicalactivitiesbySDS-PAGE．Bradfordmethod，ELISA，AgarDoubleImmunodiffusion，Westem
