羅非魚無乳鏈球菌分離、鑒定及致病性研究

《羅非魚無乳鏈球菌分離、鑒定及致病性研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。

1、羅非魚無乳鏈球菌的分離、鑒定及致病性研究張新艷，樊海平，鐘全福，卓玉琛，林煜，曾占?jí)眩ǜ＝ㄊ〉a(chǎn)研究所，福建福州350002）摘要：從患暴發(fā)性流行病羅非魚的肝臟中分離獲得一株細(xì)菌TL60829NA；將TL60829NA對(duì)羅非魚進(jìn)行人工感染致病性試驗(yàn)，試驗(yàn)感染羅非魚表現(xiàn)出自然發(fā)病癥狀，確認(rèn)分離菌株為羅非魚暴發(fā)性流行病的致病菌。分離株菌經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、BioMerieuxVitek全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)GPI測(cè)定卡分析和16SrRNA特異性基因序列與NCBI中收錄的其它引起羅非魚病害的鏈球菌的16SrDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示，分離細(xì)菌與其它無乳鏈球菌的16S

2、rDNA序列構(gòu)成一個(gè)進(jìn)化分支，而海豚鏈球菌則構(gòu)成另一分支，確定分離菌株為無乳鏈球菌(Streptococcusagalaciate)。分離菌株對(duì)氨芐西林、青霉素G、卡那霉素等28種試驗(yàn)藥物敏感，對(duì)妥布霉素、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星等15種試驗(yàn)藥物不敏感。由無乳鏈球菌引起的羅非魚暴發(fā)性流行病的主要病理變化為鰓小片結(jié)構(gòu)崩解，鰓上皮增生、融合；心肌纖維變性、肌間白細(xì)胞浸潤；肝臟顆粒變性和脂肪變性；腸道粘膜上皮變性、壞死、脫落、固有膜炎性白細(xì)胞浸潤；腎臟組織大量嗜中性白細(xì)胞浸潤，腎小管上皮細(xì)胞核固縮，小動(dòng)脈血管壁玻璃樣變性；眼睛的脈絡(luò)膜和眶骨膜組織炎性壞死，晶狀體纖維斷裂和脫

3、離。關(guān)鍵詞：羅非魚；無乳鏈球菌；致病性；細(xì)菌鑒定；藥物敏感；組織病理中圖分類號(hào)：文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：近年在福建、廣東、海南等省的養(yǎng)殖羅非魚中暴發(fā)一種流行病，病魚主要癥狀為：體色發(fā)黑，臨死前于水面打轉(zhuǎn)或間隙性竄游，部分病魚眼球突出或混濁發(fā)白，腹部體表具點(diǎn)狀或收稿日期：2007-11-28基金項(xiàng)目：福建省海洋與漁業(yè)科技項(xiàng)目(閩海漁科06214號(hào))作者簡介：張新艷，（1980-），女，福建永泰人，碩士，從事水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病害研究。TeL：0591-83732002，E-mail：swallowz47@163.com通訊作者：樊海平TeL：0591-83796968，E

4、-mail：fanhaiping@tom.com12斑塊出血或潰瘍，鰓蓋內(nèi)側(cè)出血，肝臟、膽囊、脾臟腫大，嚴(yán)重時(shí)糜爛，腸道和胃積水或積黃色粘液。流行于春、夏和秋季，流行高峰為5～9月，流行水溫25℃～37℃，主要危害親魚及100g以上的幼魚和成魚，傳染性強(qiáng)，發(fā)病率達(dá)10%～30%，死亡率達(dá)25%～80%，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本暴發(fā)性流行病的主要癥狀和流行情況與國內(nèi)報(bào)道的羅非魚海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)病相似[1－3]，但國外報(bào)道羅非鏈球菌病的病原主要有無乳鏈球菌(S.agalaciate)和海豚鏈球菌[4]。本文報(bào)道由無乳鏈球菌引起的養(yǎng)殖羅

5、非魚暴發(fā)性流行病的病原菌分離、鑒定和致病性等研究結(jié)果。1材料與方法1.1試驗(yàn)材料1.1.1試驗(yàn)用魚2006年8月，自廣州鷺業(yè)水產(chǎn)公司獅嶺羅非魚養(yǎng)殖場采集具暴發(fā)性流行病典型癥狀的病魚；試驗(yàn)用健康羅非魚取自福建省淡水水產(chǎn)研究所融橋中試基地的健康羅非魚(Oreochrimisniloticus×Oaureus)，體重為150±10g。塑料袋充氧運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，于水族箱暫養(yǎng)5d，暫養(yǎng)期間不投餌，連續(xù)充氣，水溫25℃～28℃，穩(wěn)定后1周后供人工感染用。1.1.2培養(yǎng)基、試劑、藥敏紙片營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、腦心浸液培養(yǎng)基（BHI）購自北京陸橋公司產(chǎn)品；血瓊脂、胰蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂糖

6、購自廈門泰京生物技術(shù)公司；Taq酶、10×PCR緩沖液、dNTP、pMD-18T載體、DNAMarkerDL2000購自大連寶生物（Takara）公司；膠回收試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、無Dnase/Rnase水購自TIANGEN公司；引物fD1（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'），rD1（5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）由上海鼎安測(cè)序公司合成；藥敏紙片購自北京天壇中國藥品生物制品檢定所。1.2試驗(yàn)方法1.2.1涂片檢查病原體　　以無菌器具解剖病魚，分別取鰓、肝臟、腎臟、脾臟、性腺、眼球等器官的小塊組織，于潔凈載玻片涂

7、片，風(fēng)干后，革蘭氏染色，于OlympusCX41油鏡下檢查。1.2.2病原菌的分離、純化　　取活的具典型癥狀的病魚，無菌生理鹽水沖洗體表三遍，無菌解剖后，無菌接種環(huán)自肝臟、腎臟和體表潰瘍處取樣，BHI培養(yǎng)基平板劃線涂布，28℃恒溫培養(yǎng)36h～48h后，挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢(shì)單菌落進(jìn)一步劃線純化，直至獲得純培養(yǎng)物12后，接種營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)48h，加無菌甘油后，-80℃保存?zhèn)溆谩?.2.3人工感染試驗(yàn)取-80℃保存的試驗(yàn)用菌株接種BHI平板，28℃培養(yǎng)24h，無菌生理鹽水洗下培養(yǎng)物并10倍梯度稀釋成不同濃度的菌懸液，腹腔注射暫養(yǎng)穩(wěn)定后的試驗(yàn)用健康羅非魚

8、，每尾注射