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《受體相互作用蛋白激酶1抑制劑Necrostatin-1對(duì)小鼠急性肺損傷的治療作用及分子機(jī)制研究.pdf》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、分類號(hào)：R722密級(jí)：公開(kāi)學(xué)校代碼：11065學(xué)號(hào)：Y0114130039專業(yè)博士學(xué)位論文受體相互作用蛋白激酶1抑制劑Necrostatin-1對(duì)小鼠急性肺損傷的治療作用及分子機(jī)制研究作者姓名管恩芹指導(dǎo)教師姜紅教授專業(yè)領(lǐng)域兒科學(xué)培養(yǎng)單位醫(yī)學(xué)部?jī)嚎茖W(xué)系答辯日期2018年5月13日1受體相互作用蛋白激酶1抑制劑Necrostatin-1對(duì)小鼠急性肺損傷的治療作用及分子機(jī)制研究摘要目的：本研究通過(guò)脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)建立小鼠急性肺損傷（AcuteLungInjury,AL
2、I）模型，探索受體相互作用蛋白（Receptor-interactprotein，RIP）家族成員在ALI模型中的作用，并對(duì)急性肺損傷小鼠給予RIP-1抑制劑Necrostatin-1干預(yù)治療。通過(guò)檢測(cè)小鼠肺組織組病理學(xué)改變、肺灌洗液中相關(guān)炎癥因子的表達(dá)、髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性，以及肺組織RIP激酶家族的表達(dá)、體內(nèi)生存期的變化、necrostatin-1在組織及體外細(xì)胞水平的信號(hào)通路、炎癥反應(yīng)的作用，探討急性肺損傷的發(fā)病機(jī)制，以及RIP-1抑制劑Necrostatin-1作為潛在急性肺損傷治療策略的
3、可行性。材料和方法：1.ALI模型的建立選取12只8周齡BALB/c雄性小鼠為研究對(duì)象，隨機(jī)分為對(duì)照組和ALI（脂多糖誘導(dǎo)ALI）組，每組各6只。ALI組通過(guò)尾靜脈注射脂多糖（LPS，10mg/kg）誘導(dǎo)ALI，對(duì)照組通過(guò)尾靜脈注射相同體積的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）。兩組小鼠均在造模后24h，斷頸處死小鼠，剝離小鼠肺組織，組織病理學(xué)染色（H&E）檢測(cè)小鼠肺組織病理；利用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）評(píng)估肺灌洗液和血液中炎癥相關(guān)因子白細(xì)胞介素（IL）-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-8、IL-1
4、β、環(huán)氧合酶-2（COX-2）、單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）的表達(dá)情況，以此來(lái)評(píng)價(jià)ALI模型的建立效果。2.利用蛋白質(zhì)印跡（Westernblot）和免疫組織化學(xué)（IHC）染色測(cè)定對(duì)照組和ALI組的小鼠肺組織中RIP激酶家族（RIP-1，RIP-2和RIP-3）的表達(dá)水平。3．necrostatin-1體內(nèi)實(shí)驗(yàn)將18只8周齡的BALB/c雄性小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、ALI（LPS+DMSO）組、necrostatin-1組，每組6只。ALI組和necrostatin-1組小鼠行LPS誘導(dǎo)AL（I方法同1
5、ALI組），對(duì)照組為正常對(duì)照組（方法同1對(duì)照組）。necrostatin-1組在LPS經(jīng)尾靜脈注射建模的同時(shí)，腹腔注射特異性RIP-1抑制劑necrostatin-1（10mg/kg）;ALI組在LPS經(jīng)尾靜脈注射建模的同時(shí)，腹腔注射二甲基亞砜（DMSO），作為necrostatin-1治療組對(duì)照。觀察各組小鼠生存時(shí)間，以及肺組織的組織病理學(xué)變化。在necrostatin-1和二甲基亞砜腹腔注射24小時(shí)后，斷頸處死小鼠，剝離小鼠肺組織、收集肺灌洗液，然后分別利用組織病理學(xué)技術(shù)和免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)小
6、鼠肺組織形態(tài)和RIP-1表達(dá)情況；利用Westernblot檢測(cè)小鼠肺組織中RIP-1的表達(dá)情況和下游靶標(biāo)NF-κB信號(hào)通路蛋白的表達(dá)情況；利用ELISA檢測(cè)肺灌洗液和血液中炎癥相關(guān)I因子IL-6、TNF-α、IL-8、IL-1β、COX-2、MCP-1的表達(dá)情況；測(cè)定小鼠肺組織中髓過(guò)氧化物酶（MPO）活性。4.細(xì)胞水平的研究將小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞分為對(duì)照組、DMSO+LPS組、necrostatin-1+LPS三組。其中，DMSO+LPS組和necrostatin-1+LPS組中，經(jīng)LPS
7、處理后，分別利用溶劑對(duì)照DMSO和necrostatin-1進(jìn)行處理。然后收集小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞總蛋白和細(xì)胞培養(yǎng)上清，利用westernblot檢測(cè)細(xì)胞中RIP-1和IKKα（inhibitorofnuclearfactorkappa-Bkinase-α），NF-κBp50和NF-κBp65蛋白的表達(dá)；利用ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎癥相關(guān)因子IL-6、TNF-α、IL-8、IL-1β、COX-2、MCP-1的表達(dá)情況。結(jié)果：1.LPS誘導(dǎo)的肺損傷模型的建立和鑒定病理學(xué)H&E染色鏡檢發(fā)現(xiàn)
8、，ALI組與對(duì)照組相比，注射LPS的ALI組小鼠中出現(xiàn)典型的肺損傷現(xiàn)象，肺泡結(jié)構(gòu)大面積破壞，廣泛的肺水腫，肺泡間隔增厚，肺泡嚴(yán)重出血，肺泡塌陷，以及明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺損傷評(píng)分升高（p<0.05）。ELISA檢測(cè)炎癥因子發(fā)現(xiàn)，ALI組與對(duì)照組相比，ALI組的肺灌洗液（BALF）和肺組織中IL-6、TNF-α、IL-8、IL-1β、COX-2、MCP-1表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（p<0.05）。2.LPS誘導(dǎo)的肺損傷對(duì)RIP家族蛋白的影響We
