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1、分類號：R722密級：公開學校代碼：11065學號：Y0114130039專業(yè)博士學位論文受體相互作用蛋白激酶1抑制劑Necrostatin-1對小鼠急性肺損傷的治療作用及分子機制研究作者姓名管恩芹指導教師姜紅教授專業(yè)領域兒科學培養(yǎng)單位醫(yī)學部兒科學系答辯日期2018年5月13日1受體相互作用蛋白激酶1抑制劑Necrostatin-1對小鼠急性肺損傷的治療作用及分子機制研究摘要目的：本研究通過脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）誘導建立小鼠急性肺損傷（AcuteLungInjury,AL
2、I）模型，探索受體相互作用蛋白（Receptor-interactprotein，RIP）家族成員在ALI模型中的作用，并對急性肺損傷小鼠給予RIP-1抑制劑Necrostatin-1干預治療。通過檢測小鼠肺組織組病理學改變、肺灌洗液中相關炎癥因子的表達、髓過氧化物酶(MPO)活性，以及肺組織RIP激酶家族的表達、體內生存期的變化、necrostatin-1在組織及體外細胞水平的信號通路、炎癥反應的作用，探討急性肺損傷的發(fā)病機制，以及RIP-1抑制劑Necrostatin-1作為潛在急性肺損傷治療策略的
3、可行性。材料和方法：1.ALI模型的建立選取12只8周齡BALB/c雄性小鼠為研究對象，隨機分為對照組和ALI（脂多糖誘導ALI）組，每組各6只。ALI組通過尾靜脈注射脂多糖（LPS，10mg/kg）誘導ALI，對照組通過尾靜脈注射相同體積的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）。兩組小鼠均在造模后24h，斷頸處死小鼠，剝離小鼠肺組織，組織病理學染色（H&E）檢測小鼠肺組織病理；利用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）評估肺灌洗液和血液中炎癥相關因子白細胞介素（IL）-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-8、IL-1
4、β、環(huán)氧合酶-2（COX-2）、單核細胞趨化蛋白1（MCP-1）的表達情況，以此來評價ALI模型的建立效果。2.利用蛋白質印跡（Westernblot）和免疫組織化學（IHC）染色測定對照組和ALI組的小鼠肺組織中RIP激酶家族（RIP-1，RIP-2和RIP-3）的表達水平。3．necrostatin-1體內實驗將18只8周齡的BALB/c雄性小鼠隨機分為對照組、ALI（LPS+DMSO）組、necrostatin-1組，每組6只。ALI組和necrostatin-1組小鼠行LPS誘導AL（I方法同1
5、ALI組），對照組為正常對照組（方法同1對照組）。necrostatin-1組在LPS經尾靜脈注射建模的同時，腹腔注射特異性RIP-1抑制劑necrostatin-1（10mg/kg）;ALI組在LPS經尾靜脈注射建模的同時，腹腔注射二甲基亞砜（DMSO），作為necrostatin-1治療組對照。觀察各組小鼠生存時間，以及肺組織的組織病理學變化。在necrostatin-1和二甲基亞砜腹腔注射24小時后，斷頸處死小鼠，剝離小鼠肺組織、收集肺灌洗液，然后分別利用組織病理學技術和免疫組織化學染色技術檢測小
6、鼠肺組織形態(tài)和RIP-1表達情況；利用Westernblot檢測小鼠肺組織中RIP-1的表達情況和下游靶標NF-κB信號通路蛋白的表達情況；利用ELISA檢測肺灌洗液和血液中炎癥相關I因子IL-6、TNF-α、IL-8、IL-1β、COX-2、MCP-1的表達情況；測定小鼠肺組織中髓過氧化物酶（MPO）活性。4.細胞水平的研究將小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞分為對照組、DMSO+LPS組、necrostatin-1+LPS三組。其中，DMSO+LPS組和necrostatin-1+LPS組中，經LPS
7、處理后，分別利用溶劑對照DMSO和necrostatin-1進行處理。然后收集小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞總蛋白和細胞培養(yǎng)上清，利用westernblot檢測細胞中RIP-1和IKKα（inhibitorofnuclearfactorkappa-Bkinase-α），NF-κBp50和NF-κBp65蛋白的表達；利用ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清中炎癥相關因子IL-6、TNF-α、IL-8、IL-1β、COX-2、MCP-1的表達情況。結果：1.LPS誘導的肺損傷模型的建立和鑒定病理學H&E染色鏡檢發(fā)現
8、，ALI組與對照組相比，注射LPS的ALI組小鼠中出現典型的肺損傷現象，肺泡結構大面積破壞，廣泛的肺水腫，肺泡間隔增厚，肺泡嚴重出血，肺泡塌陷，以及明顯的炎癥細胞浸潤，肺損傷評分升高（p<0.05）。ELISA檢測炎癥因子發(fā)現，ALI組與對照組相比，ALI組的肺灌洗液（BALF）和肺組織中IL-6、TNF-α、IL-8、IL-1β、COX-2、MCP-1表達水平顯著高于對照組（p<0.05）。2.LPS誘導的肺損傷對RIP家族蛋白的影響We
