豬流行性腹瀉病毒s部分基因的表達、抗體制備及間接elisa方法的建立

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1、安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)位論文豬流行性腹瀉病毒S部分基因的表達、抗體制備及間接ELISA方法的建立Expressionoffragmentalspikegeneofporcineepidemicdiarrheavirus,antibodypreparationandpreliminaryestablishmentofanindirectELISA研究生：王國松指導(dǎo)教師：張明教授合作指導(dǎo)教師：李震研究員申請學(xué)位門類級別：理學(xué)碩士專業(yè)名稱：微生物學(xué)研究方向：微生物生理學(xué)所在學(xué)院：生命科學(xué)學(xué)院答辯委員會主席：2015年5月獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的論文是

2、我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)或其它教育機構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。研究生簽名：時間：年月日關(guān)于論文使用授權(quán)的說明本人完全了解安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)可以用不同方式在不同媒

3、體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。研究生簽名：時間：年月日第一導(dǎo)師簽名：時間：年月日1摘要豬流行性腹瀉(PED)是一種急性、感染性高的腸道病毒性疾病，對新生豬仔造成很高的死亡率，豬流行性腹瀉病毒（PEDV）為其致病原。PEDV屬于尼多病毒目、冠狀病毒科，α冠狀病毒亞科（或?qū)伲?，基因組為單股正義RNA病毒，基因組大小約28kb。PEDV變異較大，其臨床癥狀、病理變化以及流行特點都與傳染性胃腸炎和輪狀病毒病的十分相似。目前，PED在世界范圍內(nèi)廣泛流行，但還沒有很好的預(yù)防和診斷方法。為此本研究選擇PEDVS基因的保守序列進行原核表達，制備

4、相應(yīng)抗體，并初步建立一套檢測PEDV抗體的間接ELISA方法。具體研究內(nèi)容如下：1PEDV部分S基因的合成及重組質(zhì)粒的構(gòu)建通過DNAstar軟件對豬流行性腹瀉病毒流行毒株S基因進行序列比對與分析，選取位于502-641氨基酸位置處的S1蛋白保守序列，利用大腸桿菌密碼子偏嗜性進行密碼子優(yōu)化，OverlapPCR合成，獲得417bp基因片段，連接到克隆載體pJET/1.2-blunt上，并構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET32a-S417和pXXGST-S417。2重組質(zhì)粒的表達與純化將獲得的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細胞進行誘導(dǎo)表達，并通過割膠純

5、化，獲得重組蛋白GST-S417，分子量31kD左右，濃度0.3mg/mL左右，純度達95%以上；通過過柱純化，獲得重組蛋白His-S417，分子量30kD左右，濃度0.1mg/mL左右，純度達90%以上。3多克隆抗體的制備以純化的GST-S417重組蛋白作為免疫原，免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，免疫量500μg/只。以純化的His-S417重組蛋白作為包被抗原，檢測免疫血清中抗體的效價，ELISA檢測結(jié)果表明血清效價達1:10000以上，而且制備的多克隆抗體能特異性識別目的蛋白。該研究表明所選的S蛋白區(qū)域具有一定的抗原性。4間接ELI

6、SA檢測方法的初步建立包被純化的GST-S417蛋白，摸索最佳間接ELISA條件，結(jié)果顯示：包被量0.32μg/孔，血清最佳稀釋比1:800，HRP標記的抗豬抗體稀釋比為1:3000時，檢測效果最好，陰性臨界值為0.340，有良好的重復(fù)性和特異性，與市場銷售的診斷試劑盒符合率較高，達72.7%，為進一步開發(fā)診斷試劑盒提供了理論和技術(shù)基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：PEDV，S蛋白，原核表達，抗體，間接ELISAIAbstractPorcineepidemicdiarrhea(PED)isanacute,highlycontagiousanddevastat

7、ingviralentericdiseaseandithasahighmortalityrateinsucklingpigs.Thecausalagentisporcineepidemicdiarrheavirus(PEDV)belongingtotheOrderNidovirales,thefamilyCoronaviridaeandthegenusAlphacoronavirus.Itsgenomeisa28kbsingle-strandedpositivesenseRNA.PEDhasoutbrokenworldwide,butth

8、ereisstillnoeffectivemethodtodiagnosisandcontroltheseveredisease.Theaimoftheresearchwastoestabli