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《豬流行性腹瀉病毒s部分基因的表達(dá)、抗體制備及間接elisa方法的建立》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)位論文豬流行性腹瀉病毒S部分基因的表達(dá)、抗體制備及間接ELISA方法的建立Expressionoffragmentalspikegeneofporcineepidemicdiarrheavirus,antibodypreparationandpreliminaryestablishmentofanindirectELISA研究生：王國松指導(dǎo)教師：張明教授合作指導(dǎo)教師：李震研究員申請學(xué)位門類級別：理學(xué)碩士專業(yè)名稱：微生物學(xué)研究方向：微生物生理學(xué)所在學(xué)院：生命科學(xué)學(xué)院答辯委員會(huì)主席：2015年5月獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的論文是
2、我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。研究生簽名：時(shí)間：年月日關(guān)于論文使用授權(quán)的說明本人完全了解安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)可以用不同方式在不同媒
3、體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。研究生簽名：時(shí)間：年月日第一導(dǎo)師簽名：時(shí)間：年月日1摘要豬流行性腹瀉(PED)是一種急性、感染性高的腸道病毒性疾病，對新生豬仔造成很高的死亡率，豬流行性腹瀉病毒（PEDV）為其致病原。PEDV屬于尼多病毒目、冠狀病毒科，α冠狀病毒亞科（或?qū)伲?，基因組為單股正義RNA病毒，基因組大小約28kb。PEDV變異較大，其臨床癥狀、病理變化以及流行特點(diǎn)都與傳染性胃腸炎和輪狀病毒病的十分相似。目前，PED在世界范圍內(nèi)廣泛流行，但還沒有很好的預(yù)防和診斷方法。為此本研究選擇PEDVS基因的保守序列進(jìn)行原核表達(dá)，制備
4、相應(yīng)抗體，并初步建立一套檢測PEDV抗體的間接ELISA方法。具體研究內(nèi)容如下：1PEDV部分S基因的合成及重組質(zhì)粒的構(gòu)建通過DNAstar軟件對豬流行性腹瀉病毒流行毒株S基因進(jìn)行序列比對與分析，選取位于502-641氨基酸位置處的S1蛋白保守序列，利用大腸桿菌密碼子偏嗜性進(jìn)行密碼子優(yōu)化，OverlapPCR合成，獲得417bp基因片段，連接到克隆載體pJET/1.2-blunt上，并構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-S417和pXXGST-S417。2重組質(zhì)粒的表達(dá)與純化將獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并通過割膠純
5、化，獲得重組蛋白GST-S417，分子量31kD左右，濃度0.3mg/mL左右，純度達(dá)95%以上；通過過柱純化，獲得重組蛋白His-S417，分子量30kD左右，濃度0.1mg/mL左右，純度達(dá)90%以上。3多克隆抗體的制備以純化的GST-S417重組蛋白作為免疫原，免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，免疫量500μg/只。以純化的His-S417重組蛋白作為包被抗原，檢測免疫血清中抗體的效價(jià)，ELISA檢測結(jié)果表明血清效價(jià)達(dá)1:10000以上，而且制備的多克隆抗體能特異性識別目的蛋白。該研究表明所選的S蛋白區(qū)域具有一定的抗原性。4間接ELI
6、SA檢測方法的初步建立包被純化的GST-S417蛋白，摸索最佳間接ELISA條件，結(jié)果顯示：包被量0.32μg/孔，血清最佳稀釋比1:800，HRP標(biāo)記的抗豬抗體稀釋比為1:3000時(shí)，檢測效果最好，陰性臨界值為0.340，有良好的重復(fù)性和特異性，與市場銷售的診斷試劑盒符合率較高，達(dá)72.7%，為進(jìn)一步開發(fā)診斷試劑盒提供了理論和技術(shù)基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：PEDV，S蛋白，原核表達(dá)，抗體，間接ELISAIAbstractPorcineepidemicdiarrhea(PED)isanacute,highlycontagiousanddevastat
7、ingviralentericdiseaseandithasahighmortalityrateinsucklingpigs.Thecausalagentisporcineepidemicdiarrheavirus(PEDV)belongingtotheOrderNidovirales,thefamilyCoronaviridaeandthegenusAlphacoronavirus.Itsgenomeisa28kbsingle-strandedpositivesenseRNA.PEDhasoutbrokenworldwide,butth
8、ereisstillnoeffectivemethodtodiagnosisandcontroltheseveredisease.Theaimoftheresearchwastoestabli
