大鼠bmscs成骨誘導及復合支架構建組織工程骨的研究

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1、分類號：R681學校代碼：10062密級：學號：2012602821學位類別：科學學位?專業(yè)學位?學科門類：醫(yī)學碩士學位論文MASTER’SDISSERTATION論文題目：大鼠BMSCs成骨誘導及復合支架構建組織工程骨的研究TITLE：ResearchofratBMSCsosteogenicandcompositescaffoldsfortissueengineeringbone一級學科：臨床醫(yī)學二級學科：外科學骨外科論文作者：年爭好指導教師：李暉導師組成員：李瑞欣天津醫(yī)科大學研究生院二〇一五年五月學位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：

2、所呈交的論文是我個人在導師指導下獨立進行研究工作取得的研究成果。除了文中特別加以標注引用的內(nèi)容和致謝的地方外，論文中不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。學位論文作者簽名：日期：年月日學位論文版權使用授權書本學位論文作者完全了解天津醫(yī)科大學有關保留、使用學位論文的規(guī)定，即：學校有權將學位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關數(shù)據(jù)庫進行檢索，并采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編以供查閱和借閱。同意學校向國家有關部門或機構送交論文，并編入有關數(shù)據(jù)庫

3、。保密，在年解密后適用本授權書。本論文屬于不保密?。（請在相對應的方框內(nèi)打“√”）學位論文作者簽名：日期：年月日導師簽名：日期：年月日天津醫(yī)科大學碩士學位論文中文摘要目的：本研究以納米羥基磷灰石、膠原蛋白、絲素蛋白為原料制備仿生骨組織工程三維支架，并評價支架材料的孔隙率、孔徑大小、吸水率及生物力學性能。提取Wistar大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞并成骨方向誘導，檢測細胞形態(tài)變化、堿性磷酸酶染色、鈣結節(jié)染色及I型膠原和骨鈣素表達鑒定成骨誘導活性。將成骨方向誘導的骨髓間充質(zhì)干細胞與制備支架復合培養(yǎng)以檢測其細胞生物相容性及構建組織工程化骨的可行性

4、。方法：1.三維支架材料的制備：冷凍干燥法制備納米羥基磷灰石、膠原蛋白、絲素蛋白(Nano-HA、COL、SF)質(zhì)量比分別為1：1：5（A組）、1：2：5（B組）及1：3：5（C組）三組復合支架。改良液體位移法測定支架孔隙率；質(zhì)量差值法測量吸水膨脹率；Instron5865力學試驗機測定力學性能；掃描電鏡（SEM）觀察支架內(nèi)部微觀結構。2.大鼠BMSCs細胞的提取及培養(yǎng)：脫頸法處死Wistar大鼠，無菌條件下提取股骨、脛骨內(nèi)骨髓間充質(zhì)干細胞，以10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基原代培養(yǎng)，并傳代，傳至第3代，待用。3.BMSCs細

5、胞成骨方向誘導干預及分組：取生長良好的第3代BMSCs細5-1胞，按1×10L的細胞濃度接種于無菌24孔板內(nèi)，分為實驗組與對照組2組；每組12孔，每組再各分4個亞組，需要染色的組別預先在孔內(nèi)放入經(jīng)滅菌處理的蓋玻片。分別對各相應組內(nèi)細胞作堿性磷酸酶（ALP）染色，鈣結節(jié)茜素紅染色，以及Ｉ型膠原和骨鈣素表達的檢測。干預措施為：實驗組以含成骨誘導劑的DMEM/F12完全培養(yǎng)液培養(yǎng)；對照組則僅用含胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。各組均每3天換細胞培養(yǎng)液1次，換液量相等。4.成骨誘導后的細胞接種于三維支架復合培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)后的第2

6、、4、6、8、12d做MTT細胞活性檢測；另外取培養(yǎng)第8d的復合培養(yǎng)物作掃描電鏡觀察以及組織HE切片染色。結果：1.三組支架材料均為三維多孔結構，具有一定的孔徑及孔隙率。B組支架更符合要求：孔徑98~260μm，平均孔徑為177μm；孔隙率為(96.72±2.78)%；吸水膨脹率為(549.37±35.29)%；生物力學試驗機測定其力學性能穩(wěn)定、壓縮應I天津醫(yī)科大學碩士學位論文變以及彈性模量等指標適宜骨組織工程研究應用。2.提取BMSCs細胞及誘導培養(yǎng)：提取的BMSCs原代細胞為單個核細胞，2形態(tài)大部分為球形，25cm培養(yǎng)瓶內(nèi)體外培

7、養(yǎng)1~3天后，可見細胞呈橢圓形、球形貼壁生長。繼續(xù)培養(yǎng)后，圓形貼壁細胞的數(shù)量明顯減少。培養(yǎng)5~7天后，形態(tài)以梭形為主。成骨誘導第2~3天后細胞形態(tài)發(fā)生改變，由梭形變?yōu)槎嘟切危?天時以多角形為主。ALP染色可見多個胞質(zhì)內(nèi)、細胞核內(nèi)染色均呈陽性表現(xiàn)。培養(yǎng)21天后作細胞爬片的茜素紅染色鈣結節(jié)，可見細胞染色呈深紅色或橘紅色的鈣鹽沉積，細胞與細胞之間呈團塊狀。結節(jié)團塊的大小及形態(tài)不一，數(shù)個或多個礦化結節(jié)可融合成塊。經(jīng)檢測I型膠原和骨鈣素表達均呈陽性。3.誘導細胞與支架復合培養(yǎng)后掃描電鏡及HE切片染色結果顯示，支架內(nèi)有大量細胞長入，生長狀態(tài)良好

8、，完全伸展。支架內(nèi)部結構被一層細胞基質(zhì)覆蓋，孔與孔之間有細胞長入。MTT檢測結果為細胞在一定時間內(nèi)呈對數(shù)生長。結論：1.三組支架均為三維多孔結構，B組支架在孔徑大小、孔隙率及力學性能等方面更適用于骨組織工程需求。2.經(jīng)檢測ALP、鈣結