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《豬白介素18IL18成熟蛋白基因的原核表達及真核表達》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、沈陽農業(yè)大學碩士學位論文豬白介素-18（IL-18）成熟蛋白基因的原核表達及真核表達姓名：耿慶華申請學位級別：碩士專業(yè)：臨床獸醫(yī)學指導教師：杜紹范;曹殿軍2003.6.1沈陽農業(yè)大學碩士學位論文捅要，，白細胞介素．18是近年發(fā)現的一種免疫調節(jié)因子，起初由于它能誘導NK細胞和n1細胞產生干擾素而被命名為干擾素誘生因子(Interferon—y-inducingfactor，IGⅢ)。隨著對IL-18的深入研究，人們發(fā)現也．18有它本身的結構特點和很多其它生物學活性，因此于1996年被正式命名為白細
2、胞介素-18(Imerleukin-18，IL-18)。從IL-18被發(fā)現以來，人們對其進行了大量的實驗研究，通過研究人們發(fā)現IL-18在不同時間和不同組織的選擇性表達與很多疾病的發(fā)生、發(fā)展及治療密切相關。目前的研究顯示．IL-18不僅在抗腫瘤、抗微生物感染以及抗超敏反應等方面發(fā)揮一定的生物學功能。此外，IL．18還與自身免疫性疾病有關。由此可見IL．18具有多種生物學功能，并可能有廣闊的應用前景。所以，不同種動物的IL．18紛紛在體外被克隆和表達出來．并試圖進一步研究其生物學活性及其與疾病的關
3、系。目前．在國內豬的IL-18的體外表達還未見有報道研究．本研究即是將本實驗室已經克隆的豬IL．18基因進行亞克隆并進行體外表達，為深入研究IL-18在臨床中的應用提供材料。少本實驗的目的是對已經構建好的豬IL—18的陽性重組質粒pMDl8-T-IL一18進行亞克隆．構建豬IL．18成熟蛋白基因的原核表達載體和真核表達載體并分別轉化大腸桿菌和轉染倉鼠腎細胞(BHK21)進行IL-18成熟蛋白的表達。、為了獲得具有生物學活性的豬IL．18蛋白．，進一步探討m-18更多的功能及對其應用前景的研究和開
4、發(fā)，本實驗構建了豬IL-18基因的原核表達載體pPROEXrMHb—IL-18和真核表達載體pGFPC．IL．18，并分別轉化大腸桿菌和轉染倉鼠腎細胞(BHK21)，成功表達出豬IL-18的成熟蛋白。本實驗方法是對已經獲得的陽性重組質粒pMDl8．T-PIL-18用EeoRI和)cbaI進行雙酶切，再與用EeoRI和XbaI進行雙酶切處理的原核表達載體在DNA連接酶存花下進行連接，然后將連接產物用氯化鈣法轉化大腸桿菌BL21．經酶切和PCR鑒定．對獲得的陽性重組質粒進行核苷酸序列測定。以終濃度為
5、0．6mmoI／LIPTG誘導轉化后的大腸豐T菌使得外源目的基因IL·18得以表達·得到了高效表達的IL，l8菌體蛋白，SDS—PAGE電泳可見到表達的外源蛋白摘要大小約為23KD，與DNASIS軟件推導的分子量大小相符合，薄層灰度掃描結果顯示IL—18蛋白的表達量占菌體總蛋白的25．7％。同時，為了在真核細胞中表達成熟的IL--18蛋白，我們設計上下游引物P1、P2，上游引物即P1含有豬1I,-18的5。端同源序列和BamHI酶切位點，在BamHI酶切位點后加入了起始密碼子ATG，以啟動蛋白質
6、的翻譯過程。下游引物即P2含有3’端同源序列和Xba／酶切位點。用Pl、P2以pMDl8一T-IL．18為模板擴增IL-18外源片段，用BamHI和XbaI雙酶切PCR擴增的11_．18基因和真核表達載體，并用DNA連接酶進行連接，轉化大腸桿菌DH5a，提取質粒，并用酶切和PCR進行鑒定。將鑒定為陽性的真核表達載體質粒用脂質體轉染法轉染BHK2I細胞，經過G418抗性篩選，利用SDS．PAGE電泳分析表明表達的II_,-18目的蛋白在轉染后的細胞上清中，同時收取轉染后的細胞提取總RNA并除掉其中
7、的DNA后RT-PCR擴增出500bp左右的DNA條帶。證明已經得到可以穩(wěn)定傳代培養(yǎng)的能分泌豬IL-18蛋白的細胞系。這樣為進一步研究IL-18的結構、生物學活性及其在細胞水平和分子水平的作用機制。深入研究IL-18在疾病中的應用前景奠定了基礎。』jj關鍵詞：豬；白細胞介素．18七也．18)：原核表達；真核表達彳。、／2沈陽農業(yè)太學碩士學位論文刖舌白介素一18(1L一18)是近幾年來發(fā)現的一種免疫調節(jié)因子。它是從先經過加熱滅活的瘡皰棒狀桿菌(P．acnes)致敏后，又經脂多糖(LPS)攻擊而發(fā)生
8、中毒性休克的小鼠肝細胞中分離并克隆出來的一種新的細胞因子。由于它能弓i起小鼠血清中IFN—Y水平上升，最初被稱為IFN-Y誘導因子(IGIF)，表明它具有誘導NK細胞和_r細胞產生IFN—y的功能。最近的研究表明，除了能誘導產生IFN—Y的活性外，IL—18還具有增強Fas配體和穿孔素介導的T細胞和NK細胞的細胞毒活性作用；刺激Thl細胞的發(fā)育：上調粒細胞一巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL～2Ra；降低IL一10在T細胞中的表達和調節(jié)B細胞免疫球蛋白的分泌等～系列功能。IL—18促進炎
