豬白介素18IL18成熟蛋白基因的原核表達(dá)及真核表達(dá)

《豬白介素18IL18成熟蛋白基因的原核表達(dá)及真核表達(dá)》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。

1、沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文豬白介素-18（IL-18）成熟蛋白基因的原核表達(dá)及真核表達(dá)姓名：耿慶華申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：臨床獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：杜紹范;曹殿軍2003.6.1沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文捅要，，白細(xì)胞介素．18是近年發(fā)現(xiàn)的一種免疫調(diào)節(jié)因子，起初由于它能誘導(dǎo)NK細(xì)胞和n1細(xì)胞產(chǎn)生干擾素而被命名為干擾素誘生因子(Interferon—y-inducingfactor，IGⅢ)。隨著對IL-18的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)也．18有它本身的結(jié)構(gòu)特點和很多其它生物學(xué)活性，因此于1996年被正式命名為白細(xì)

2、胞介素-18(Imerleukin-18，IL-18)。從IL-18被發(fā)現(xiàn)以來，人們對其進行了大量的實驗研究，通過研究人們發(fā)現(xiàn)IL-18在不同時間和不同組織的選擇性表達(dá)與很多疾病的發(fā)生、發(fā)展及治療密切相關(guān)。目前的研究顯示．IL-18不僅在抗腫瘤、抗微生物感染以及抗超敏反應(yīng)等方面發(fā)揮一定的生物學(xué)功能。此外，IL．18還與自身免疫性疾病有關(guān)。由此可見IL．18具有多種生物學(xué)功能，并可能有廣闊的應(yīng)用前景。所以，不同種動物的IL．18紛紛在體外被克隆和表達(dá)出來．并試圖進一步研究其生物學(xué)活性及其與疾病的關(guān)

3、系。目前．在國內(nèi)豬的IL-18的體外表達(dá)還未見有報道研究．本研究即是將本實驗室已經(jīng)克隆的豬IL．18基因進行亞克隆并進行體外表達(dá)，為深入研究IL-18在臨床中的應(yīng)用提供材料。少本實驗的目的是對已經(jīng)構(gòu)建好的豬IL—18的陽性重組質(zhì)粒pMDl8-T-IL一18進行亞克?。畼?gòu)建豬IL．18成熟蛋白基因的原核表達(dá)載體和真核表達(dá)載體并分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌和轉(zhuǎn)染倉鼠腎細(xì)胞(BHK21)進行IL-18成熟蛋白的表達(dá)。、為了獲得具有生物學(xué)活性的豬IL．18蛋白．，進一步探討m-18更多的功能及對其應(yīng)用前景的研究和開

4、發(fā)，本實驗構(gòu)建了豬IL-18基因的原核表達(dá)載體pPROEXrMHb—IL-18和真核表達(dá)載體pGFPC．IL．18，并分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌和轉(zhuǎn)染倉鼠腎細(xì)胞(BHK21)，成功表達(dá)出豬IL-18的成熟蛋白。本實驗方法是對已經(jīng)獲得的陽性重組質(zhì)粒pMDl8．T-PIL-18用EeoRI和)cbaI進行雙酶切，再與用EeoRI和XbaI進行雙酶切處理的原核表達(dá)載體在DNA連接酶存花下進行連接，然后將連接產(chǎn)物用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21．經(jīng)酶切和PCR鑒定．對獲得的陽性重組質(zhì)粒進行核苷酸序列測定。以終濃度為

5、0．6mmoI／LIPTG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的大腸豐T菌使得外源目的基因IL·18得以表達(dá)·得到了高效表達(dá)的IL，l8菌體蛋白，SDS—PAGE電泳可見到表達(dá)的外源蛋白摘要大小約為23KD，與DNASIS軟件推導(dǎo)的分子量大小相符合，薄層灰度掃描結(jié)果顯示IL—18蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白的25．7％。同時，為了在真核細(xì)胞中表達(dá)成熟的IL--18蛋白，我們設(shè)計上下游引物P1、P2，上游引物即P1含有豬1I,-18的5。端同源序列和BamHI酶切位點，在BamHI酶切位點后加入了起始密碼子ATG，以啟動蛋白質(zhì)

6、的翻譯過程。下游引物即P2含有3’端同源序列和Xba／酶切位點。用Pl、P2以pMDl8一T-IL．18為模板擴增IL-18外源片段，用BamHI和XbaI雙酶切PCR擴增的11_．18基因和真核表達(dá)載體，并用DNA連接酶進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，提取質(zhì)粒，并用酶切和PCR進行鑒定。將鑒定為陽性的真核表達(dá)載體質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染BHK2I細(xì)胞，經(jīng)過G418抗性篩選，利用SDS．PAGE電泳分析表明表達(dá)的II_,-18目的蛋白在轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞上清中，同時收取轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞提取總RNA并除掉其中

7、的DNA后RT-PCR擴增出500bp左右的DNA條帶。證明已經(jīng)得到可以穩(wěn)定傳代培養(yǎng)的能分泌豬IL-18蛋白的細(xì)胞系。這樣為進一步研究IL-18的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)活性及其在細(xì)胞水平和分子水平的作用機制。深入研究IL-18在疾病中的應(yīng)用前景奠定了基礎(chǔ)?！籮j關(guān)鍵詞：豬；白細(xì)胞介素．18七也．18)：原核表達(dá)；真核表達(dá)彳。、／2沈陽農(nóng)業(yè)太學(xué)碩士學(xué)位論文刖舌白介素一18(1L一18)是近幾年來發(fā)現(xiàn)的一種免疫調(diào)節(jié)因子。它是從先經(jīng)過加熱滅活的瘡皰棒狀桿菌(P．a(chǎn)cnes)致敏后，又經(jīng)脂多糖(LPS)攻擊而發(fā)生

8、中毒性休克的小鼠肝細(xì)胞中分離并克隆出來的一種新的細(xì)胞因子。由于它能弓i起小鼠血清中IFN—Y水平上升，最初被稱為IFN-Y誘導(dǎo)因子(IGIF)，表明它具有誘導(dǎo)NK細(xì)胞和_r細(xì)胞產(chǎn)生IFN—y的功能。最近的研究表明，除了能誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN—Y的活性外，IL—18還具有增強Fas配體和穿孔素介導(dǎo)的T細(xì)胞和NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性作用；刺激Thl細(xì)胞的發(fā)育：上調(diào)粒細(xì)胞一巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL～2Ra；降低IL一10在T細(xì)胞中的表達(dá)和調(diào)節(jié)B細(xì)胞免疫球蛋白的分泌等～系列功能。IL—18促進炎