microRNA-449a在小鼠神經(jīng)病理性疼痛模型中的調(diào)控作用及其機(jī)制

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1、中文摘要microRNA449a在小鼠神經(jīng)病理性疼痛模型中的調(diào)控作用及其機(jī)制研究目的神經(jīng)病理性疼痛（neuropathicpain,NP）又稱為神經(jīng)痛，已經(jīng)成為了嚴(yán)重影響人類(lèi)健康的疾病難題。研究認(rèn)為，神經(jīng)病理性疼痛是因?yàn)橥庵芑蛑袠猩窠?jīng)系統(tǒng)的損傷或者功能紊亂導(dǎo)致的慢性疼痛所引起，其臨床特征通常表現(xiàn)為為痛覺(jué)過(guò)敏、自發(fā)性疼痛或異常性疼痛等，目前對(duì)于神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制尚不明確，也尚無(wú)有效的治療方案。大量研究證實(shí)，神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，可能與神經(jīng)系統(tǒng)的外周神經(jīng)感受器過(guò)敏、中樞神經(jīng)痛感神經(jīng)元異常重組以及傳入神經(jīng)的異位興奮等因素密切相關(guān)。由于臨床上缺

2、乏有效的治療方案，因此神經(jīng)病理性疼痛難以有效根治，目前全球范圍內(nèi)的患者數(shù)量越來(lái)越多，而且由于劇烈的疼痛給患者帶來(lái)巨大的身體和精神痛苦，已經(jīng)成為不容忽視的難以治愈的健康問(wèn)題。在臨床上對(duì)于神經(jīng)病理性疼痛的治療是以抗抑郁藥、抗癲癇藥以及局部麻醉劑為主，但是上述藥物的療效仍不理想，并且副作用嚴(yán)重，因此明確神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制并加快高效低毒藥物的研發(fā)，已經(jīng)成為臨床研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域?；蚪M的表達(dá)失衡是引起神經(jīng)病理性疼痛的關(guān)鍵因素，從基因水平對(duì)疾病的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行闡述具有臨床指導(dǎo)意義。miRNA是人體內(nèi)的一類(lèi)具有調(diào)控基因組表達(dá)功能的內(nèi)源性因子，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖凋

3、亡，組織分化和功能維持等方面的作用，miRNA在真核細(xì)胞中發(fā)揮調(diào)控基因表達(dá)水平的作用，主要是通過(guò)與靶基因mRNA3’非編碼區(qū)的結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)。miRNA一方面能夠與細(xì)胞質(zhì)中的蛋白結(jié)合，形成RNA干擾沉默核糖核蛋白復(fù)合物，該復(fù)合物能夠與靶基因mRNA發(fā)生互補(bǔ)而降解mRNA，從而抑制靶基因的蛋白轉(zhuǎn)錄；此外，miRNA也可以通過(guò)與mRNA的不完全互補(bǔ)抑制蛋白的轉(zhuǎn)錄。由于神經(jīng)病理性疼痛本質(zhì)上可以認(rèn)為是神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)損傷做出的應(yīng)激反應(yīng)，所發(fā)生的病理改變與各種蛋白的表達(dá)密切相關(guān)，包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子、神經(jīng)遞質(zhì)、炎性因子和離子通道蛋白等。因此miRNA通過(guò)調(diào)控不同信號(hào)通路相關(guān)

4、的蛋白表達(dá)，從而對(duì)神經(jīng)病理性疼痛的病理進(jìn)程發(fā)揮了不I同的調(diào)控作用。MiRNA其在腫瘤的作用以及機(jī)制的研究較為廣泛，并且已經(jīng)有部分研究進(jìn)入臨床應(yīng)用階段，但是對(duì)于miRNA在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用及其機(jī)制研究相對(duì)匱乏，本研究采用生物化學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)等技術(shù)主要開(kāi)展以下研究：（1）構(gòu)建小鼠坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷（sparednerveinjury，SNI）模型，采用微陣列芯片（microarray）技術(shù)檢測(cè)背根神經(jīng)節(jié)（DRG）中miRNA表達(dá)譜的變化，篩選鑒定其中具有顯著差異的miRNA；（2）觀察小鼠體內(nèi)特定miRNA過(guò)表達(dá)后對(duì)神經(jīng)病理

5、性疼痛的影響及其機(jī)制；（3）通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)揭示特定miRNA調(diào)控DRG生物學(xué)行為的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。研究方法1.采用坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷（SNI）法構(gòu)建小鼠神經(jīng)病理性疼痛模型，背根神經(jīng)節(jié)（Dorsalrootganglia，DRG）從小鼠體內(nèi)進(jìn)行分離培養(yǎng)；2.SNI小鼠模型的動(dòng)物行為學(xué)測(cè)定包括了機(jī)械性刺激誘發(fā)疼痛的行為學(xué)測(cè)定、熱刺激誘發(fā)疼痛的行為學(xué)測(cè)定、冷刺激誘發(fā)疼痛的測(cè)定；3.使用TaqMan低密度微陣列芯片篩選各樣本中差異化表達(dá)的miRNA，實(shí)驗(yàn)步驟根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)篩選得到miRNA開(kāi)展進(jìn)一步的鑒定；5.采用Targe

6、tscan、miRBase和miRGenTargets三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，并結(jié)合已有文獻(xiàn)，對(duì)miR-449a的下游靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，然后從中選擇與神經(jīng)病理性疼痛最為密切相關(guān)的靶基因作為研究目標(biāo)；6.采用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子與靶基因的啟動(dòng)子DNA相互作用7.采用DRG顯微注射術(shù)檢測(cè)外源性miRNA-449a對(duì)神經(jīng)病理性疼痛的作用；8.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和western檢測(cè)目標(biāo)基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平。本研究采用統(tǒng)計(jì)軟件SSPS18.0統(tǒng)計(jì)和分析原始數(shù)據(jù)，各組的差異水平通過(guò)t檢驗(yàn)（student’sttext）和卡方檢驗(yàn)進(jìn)行分析。研究結(jié)果1.機(jī)

7、械刺激縮足反應(yīng)閾值的測(cè)定結(jié)果表明，術(shù)前兩組小鼠的MWT基礎(chǔ)值無(wú)顯著差異，在SNI術(shù)后第3天，觀察到模型組小鼠的MWT值顯著下降至1.13±0.28g，與假手術(shù)組相比存在顯著差異（P<0.01）；在術(shù)后的第5、7天II模型組小鼠的MWT值稍有下降趨勢(shì)，并在第7天MWT達(dá)到最低值。而在非手術(shù)的對(duì)側(cè)，兩組小鼠的MWT值均無(wú)顯著差異，證實(shí)模型組小鼠的手術(shù)側(cè)對(duì)機(jī)械刺激的痛閾顯著降低，并隨術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)。2.TaqMan低密度微陣列芯片miRNA篩選結(jié)果如表1.1所示，其中miRNA-449a和miRNA-185在SNI小鼠模型的DRG中的表達(dá)有顯著性

8、差異（P<0.05）。在術(shù)后第3天，miR-449a和miRNA-185在SNI小鼠的DRG中表達(dá)均有顯著差