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1、食品科技生物工程FOODSCIENCEANDTECHNOLOGY2010年第35卷第9期果膠裂解酶基因的克隆與原核表達(dá)1,22*13122宋立立，頓寶慶，奚亞軍，彭源德，白娜，路明，李桂英(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，楊凌712100；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物質(zhì)能源研究中心，北京100081；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，長沙410205)摘要：利用PCR技術(shù)從枯草芽孢桿菌T66(Bacillussubtilis)基因組DNA中擴(kuò)增得到果膠裂解酶編碼基因pl(GU644446)，并構(gòu)建基因表達(dá)載體pPAL7-pl重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化受體菌E.coliBL21進(jìn)行原核表
2、達(dá)分析。誘導(dǎo)表達(dá)條件為溫度37℃、時(shí)間4h、IPTG濃度0.8mol/L，經(jīng)SDS-PAGE分析表明果膠裂解酶編碼基因pl表達(dá)的重組酶蛋白相對分子質(zhì)量為45ku。對該基因重組酶粗酶液的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步分析，表明該酶最適反應(yīng)溫度為50℃、最適反應(yīng)pH8，添加5.5mmol/L的2+Ca的條件下，測得果膠裂解酶的最高比酶活為30U/mL。含有果膠裂解酶編碼基因pl的重組質(zhì)粒遺傳穩(wěn)定。關(guān)鍵詞：果膠裂解酶；基因克??；原核表達(dá)；酶學(xué)特性中圖分類號(hào)：TS201.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1005-9989(2010)09-0002-06Cloningofgeneenco
3、dingpectinlyaseandexpressioninprokaryoticSONGLi-li1,2,DUNBao-qing2*,XIYa-jun1,PENGYuan-de3,BAINa1,LUMing2,LIGui-ying2(1.CollegeofAgronomyofNorthwestA&FUniversity,Yangling712100;2.BiomassEnergyResearchCenter,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081;3.InstituteofBastFiberCro
4、ps,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Changsha410205)Abstract:WithgenomicDNAofBacillussubtilisasatemplate,pectinlyasecodinggeneplwasobtainedbyPCRamplification.ThevectorpPAL7-plwasconstructedandtransformedintotherecipientbacteriumE.coliBL21.Itwasexpressedunderat37℃,inductionwith0.8
5、mol/LIPTGfor4h.SDS-PAGEanalysisrevealedthatrecombinantstrainharboringtheplasmidpPAL7-plcouldexpressthetargetprotein(45ku).Preliminarystudyonenzymaticpropertiesofrecombinantproteinshowthatoptimumtemperatureforpectatelyaseactivitywas50℃andoptimumpHforpectatelyaseactivitywas8.Theactivi
6、tyofpectatelyasewas30U/mLbyadding5.5mmol/LCa2+.Afterseveralsubsequentculture,thegeneticofrecombinantplasmidwasstable.Keywords:pectatelyase;genecloning;prokaryoticexpression;enzymaticproperties收稿日期：2010-02-23*通訊作者基金項(xiàng)目：國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2007BAD41B02)；農(nóng)業(yè)部農(nóng)村能源綜合建設(shè)項(xiàng)目(2130138-018)；中央級公益性科研院所基本科研
7、業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資助項(xiàng)目(2060302-13)。作者簡介：宋立立(1983—)，女，河北滄州人，碩士研究生，主要從事農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究的工作。·2·食品科技2010年第35卷第9期FOODSCIENCEANDTECHNOLOGY生物工程果膠酶是廣泛存在于果實(shí)及多種微生物中可DNA提取試劑盒：天根公司；其他試劑：國產(chǎn)分以作用于果膠質(zhì)的一類由許多單酶組成的復(fù)合酶析純。[1]的總稱。果膠酶在苧麻脫膠、木材防腐和酒精發(fā)1.2方法酵等領(lǐng)域有重要的應(yīng)用意義，并且廣泛應(yīng)用于食1.2.1LB培養(yǎng)基配置和培養(yǎng)條件LB培養(yǎng)基配置品工業(yè)。參見文獻(xiàn)[8]。轉(zhuǎn)化子的選擇用含有氨芐青霉素(10
8、0果膠裂解酶是果膠酶的重要組成部分，能
