血清蛋白質(zhì)濃度定量測(cè)定

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1、BCA法定量蛋白質(zhì)濃度BCA法是近來(lái)廣為應(yīng)用的蛋白定量方法。操作簡(jiǎn)便，快速，靈敏度高，準(zhǔn)確，試劑穩(wěn)定性好，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，抗干擾能力強(qiáng)【原理】：堿性條件下，蛋白將Cu2+還原為Cu+，Cu+與BCA試劑形成紫顏色的絡(luò)合物，測(cè)定其在562nm處的吸收值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)比，即可計(jì)算待測(cè)蛋白的濃度?！驹怼浚夯驹鞡CA(bicinchoninicacid)法蛋白濃度定量：在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)與Cu2+絡(luò)合并將Cu2+還原成Cu+（biuretreaction）。BCA與Cu+結(jié)合形成穩(wěn)定的紫藍(lán)色復(fù)合物，在562nm處有高的光吸收值并與蛋白質(zhì)濃度成正比，據(jù)此可測(cè)定蛋白質(zhì)濃度?！驹?/p>

2、劑】1、試劑A：分別稱(chēng)取10gBCA二鈉鹽、20g無(wú)水碳酸鈉、0.16g酒石酸鈉、4g氫氧化鈉、9.5g碳酸氫鈉，混合調(diào)PH值至11.25，加水至1L。2、試劑B：4％硫酸銅。3、BCA工作液：試劑A100ml＋試劑B2ml混合。操作步驟1.先將solutionA搖晃混勻，根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積solutionA加1體積solutionB試劑（50:1）配制成BCA工作液，充分混勻。BCA工作液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。2、蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液：用結(jié)晶牛血清白蛋白(BSA)根據(jù)其純度用生理鹽水配制成1.5mg/ml的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液。（純度可經(jīng)凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量而確定）3.繪制標(biāo)

3、準(zhǔn)曲線(xiàn)：取6支試管，編號(hào)后分別加入0mL、0.02mL、0.04mL、0.06mL、0.08mL、0.1mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(BSA)，然后各管分別用去離子水補(bǔ)充到0.1mL，最后各試管中分別加入2.0mLBCA工作液，每加完一管，立即在漩渦混合器上混合（注意不要太劇烈，以免產(chǎn)生大量氣泡而難于消除），以蛋白質(zhì)的蛋白含量為橫坐標(biāo)、吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。4.樣品測(cè)定：同繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方法，在一支試管中加入待測(cè)樣品0.1mL代替標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，然后加入2.0mLBCA工作液后，立即在漩渦混合器上混合，測(cè)吸光度A，查標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求出待測(cè)樣品中蛋白質(zhì)濃度（g/L）?！緝?yōu)缺點(diǎn)】

4、(一)操作簡(jiǎn)單，快速，45分鐘內(nèi)完成測(cè)定，比經(jīng)典的Lowary法快4倍且更加方便；(二)準(zhǔn)確靈敏，試劑穩(wěn)定性好，BCA試劑的蛋白質(zhì)測(cè)定范圍是20-200μg/ml，微量BCA測(cè)定范圍在0.5-10μg/ml。(三)經(jīng)濟(jì)實(shí)用，除試管外，測(cè)定可在微板孔中就進(jìn)行，大大節(jié)約樣品和試劑用量；(四)抗試劑干擾能力比較強(qiáng)，如去垢劑，尿素等均無(wú)影響此法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，近些年被科研工作者廣泛選用。目前BCA法的試劑盒市面有售。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(BCAProteinAssayKit)是根據(jù)目前世界上最常用蛋白濃度檢測(cè)方法之一BCA法研制而成，實(shí)現(xiàn)了蛋白濃度測(cè)定的簡(jiǎn)單，高穩(wěn)定性，高

5、靈敏度和高兼容性。檢測(cè)濃度下限達(dá)到25微克/毫升，最小檢測(cè)蛋白量達(dá)到0.5微克，待測(cè)樣品體積為1～20微升。試劑盒組成2.稀釋標(biāo)準(zhǔn)品：完全溶解蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品（5mg/mlBSA(牛血清白蛋白),-20℃保存）取10微升用PBS(pH7.4的等滲磷酸鹽緩沖液)稀釋至100微升（樣品一般可用PBS稀釋?zhuān)?，使終濃度為0.5mg/ml。將稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品（0.5mg/ml）按0,2,4，6，8,12,16,20微升分別加到96孔板的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足到20微升。體積(ul)02468121620終濃度（ug/ul)00.050.10.150.20.30.40.5p

6、H7.4的等滲磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制pH7.4的等滲磷酸鹽緩沖液（0.01mol/L，pH7.4,PBS）:NaCI8.0gKH2PO40.2gNa2HPO4·12H2O2.9gKCI0.2g將上列試劑按次序加入定量容器中，加適量蒸餾水溶解后，再定容至1000mL，調(diào)pH值至7.4,高壓消毒滅菌112Kpa20min，冷卻后，保存于4℃冰箱中備用。6孔板底面積9.6cm2,加培養(yǎng)液的量2.5ml,12孔板底面積4.5cm2,加培養(yǎng)液的量2ml,24孔板底面積2cm2,加培養(yǎng)液的量1ml,96孔板底面積0.32cm2,加培養(yǎng)液的量0.1ml,摘自司徒鎮(zhèn)強(qiáng)的《細(xì)胞培

7、養(yǎng)》實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟3、待測(cè)樣品：用雙縮脲測(cè)定法的樣品稀釋而成。此法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，近些年被科研工作者廣泛選用。目前BCA法的試劑盒市面有售。總之，雖然蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法很多，但是，還沒(méi)有一個(gè)完美的方法。在選擇測(cè)定方法時(shí)，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和實(shí)驗(yàn)室條件決定。【試劑】1、試劑A：1％BCA二鈉鹽2％無(wú)水碳酸鈉0.16%酒石酸鈉0.4％氫氧化鈉0.95％碳酸氫鈉混合調(diào)PH值至11.25。2、試劑B：4％硫酸銅。3、BCA工作液：試劑A100ml＋試劑B2ml混合。4、蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液：用結(jié)晶牛血清白蛋白根據(jù)其純度用生理鹽水配制成1.5mg/ml的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液。