實(shí)驗(yàn)二、蛋白質(zhì)定量測(cè)定

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1、分光光度法(一)基本原理分光光度法是利用物質(zhì)對(duì)某種波長(zhǎng)的光具有選擇性吸收的特性建立起來(lái)的鑒別物質(zhì)或測(cè)定其含量的一項(xiàng)技術(shù)。Lambert-Beer定律，吸光度與溶液的濃液成正比，與光束通過(guò)溶液的距離(即光程)成正比，用數(shù)學(xué)表達(dá)式表示為：A=KLCC：物質(zhì)的濃度，L：光程（cm），K為吸光系數(shù)或消光系數(shù)。（二）待測(cè)溶液的濃度計(jì)算1、利用標(biāo)準(zhǔn)管法計(jì)算待測(cè)溶液的濃度：2、利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行換算：3、利用吸光系數(shù)（消光系數(shù)）求出待測(cè)溶液的濃度。根據(jù)Lambert-beer定律：標(biāo)準(zhǔn)管：As=KLCs(下標(biāo)S：標(biāo)準(zhǔn)液)待

2、測(cè)管：Ax=KLCx(下標(biāo)X：待測(cè)液)L相等，溫度相同，測(cè)定同一物質(zhì)，所用單色光相同，則K相同，則：As/Ax=Cs/Cx即Cx=Ax/As·Cs在實(shí)際操作中，常使待測(cè)管體積與標(biāo)準(zhǔn)管體積相等(以X代表測(cè)定管含量，S代表標(biāo)準(zhǔn)管含量)則：X=Ax/As·S計(jì)算待測(cè)溶液濃度時(shí)，可根據(jù)測(cè)定時(shí)實(shí)際吸取的標(biāo)準(zhǔn)液的體積(Vs)和待測(cè)樣品的體積(Vx)，將上式演變?yōu)椋捍郎y(cè)溶液濃度：Cx=Ax/As·Cs·Vs/Vx利用標(biāo)準(zhǔn)管法計(jì)算待測(cè)溶液的濃度利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行換算1．標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的作用(1)又叫做校正曲線(xiàn)或工作曲線(xiàn)。從濃度一光

3、密度直線(xiàn)的直線(xiàn)特性，判斷所采用方法的呈色反應(yīng)是否符合lambert—Beer定律。(2)作多次平行測(cè)定繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，可判斷在整個(gè)測(cè)定過(guò)程中操作、儀器等誤差的大小，確定該測(cè)定方法的可靠性。(3)從繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率可以比較各種方法的靈敏度。(4)大批樣品分析時(shí)，省略多次計(jì)算，從光密度值直接查閱標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)而求得被測(cè)物質(zhì)的濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制2．標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的作法(1)標(biāo)準(zhǔn)液濃度的選擇：標(biāo)準(zhǔn)液濃度選擇一般應(yīng)能包括待測(cè)樣品的可能變異最低與最高值，一般選擇5種濃度。濃度差距最好是成倍增加或等級(jí)增加。(2)標(biāo)準(zhǔn)液的測(cè)定：在比

4、色時(shí)，讀取光密度至少讀2-3次，求其平均值，以減少儀器不穩(wěn)定而產(chǎn)生的誤差。(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖的繪制：一般常用光密度一濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)?！静僮鳌吭噭?biāo)準(zhǔn)管測(cè)定管空白管1234567蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液(ml)0.20.40.60.81.0待測(cè)血清樣本(ml)1.00.9%NaCl(ml)0.80.60.40.21.0雙縮脲試劑(ml)4.04.04.04.04.04.04.03、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖的繪制①用普通方格紙作圖。圖紙長(zhǎng)∶寬=1∶1或長(zhǎng)∶寬=3∶2，以橫軸為濃度，縱軸為光密度。②繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)時(shí)，將各座標(biāo)點(diǎn)和原點(diǎn)連成一條線(xiàn)。

5、③若各點(diǎn)不在一直線(xiàn)，則可通過(guò)原點(diǎn)，盡可能使直線(xiàn)通過(guò)更多點(diǎn)，使不在直線(xiàn)上的點(diǎn)盡量均勻地分布在直線(xiàn)的兩邊。④座標(biāo)紙上注明：測(cè)定物及測(cè)定方法的名稱(chēng)，儀器型號(hào)、波長(zhǎng)及繪制的日期、室溫。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)根據(jù)Lambert-Beer定律，A與C成正比配制一系列標(biāo)準(zhǔn)液C1、C2、C3??，在?max下，測(cè)相應(yīng)的A1、A2、A3……。實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目,儀器型號(hào),波長(zhǎng),日期,室溫.mg/ml利用吸光系數(shù)（消光系數(shù)）求出待測(cè)溶液的濃度根據(jù)Lambert-Beer氏定律：A=KLC若C為1%（g/ml），L為1cm，此時(shí)的K值稱(chēng)為百分吸光系數(shù)用

6、E1%1cm表示.即：C=A/E1%1cm若C為1mol/L，L為1cm，其K值稱(chēng)為摩爾吸光系數(shù)，用ε表示即；C=A/ε(三)波長(zhǎng)的選擇最大吸收峰的波長(zhǎng)(λmax)根據(jù)三個(gè)原則：1.被測(cè)溶液有適當(dāng)?shù)墓饷芏龋m當(dāng)?shù)墓饷芏葹?.1-0.7，以0.2-0.6最理想。2.應(yīng)使干擾影響降低至最低限度。3.應(yīng)使標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)在盡可能大的范圍內(nèi)接近直線(xiàn)。蛋白質(zhì)定量分析技術(shù)雙縮脲法紫外分光光度法BCA（二喹啉甲酸）法Lowry法(Lowry改良法)考馬斯(Comessie)亮蘭結(jié)合法凱氏定氮法雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)含量雙縮脲(NH2

7、CONHCONH2)在堿性溶液中與硫酸銅反應(yīng)生成紫紅色化合物，稱(chēng)為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中含有許多肽鍵(-CONH-)在堿性溶液中也能與Cu2+反應(yīng)產(chǎn)生紫紅色化合物。在一定范圍內(nèi)，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。操作簡(jiǎn)便、迅速、受蛋白質(zhì)種類(lèi)性質(zhì)的影響較??；靈敏度較差，特異性不高。-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基團(tuán)也有此反應(yīng)。【原理】【操作】試劑標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定管空白管1234567蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液(ml)0.20.40.60.81.0待測(cè)血清樣本(ml)1.00.9%NaCl(ml)0.80.60.4

8、0.21.0雙縮脲試劑(ml)4.04.04.04.04.04.04.0【結(jié)果】(一)在座標(biāo)紙上以光密度為縱座標(biāo)，以蛋白質(zhì)濃度為橫座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。(二)從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中查出待測(cè)血清樣本的蛋白質(zhì)濃度(g/L)，并求出人血清樣本的蛋白質(zhì)濃度。(三)從標(biāo)準(zhǔn)管中選擇一管與測(cè)定管光密度相接近者，求出人血清樣本的蛋白質(zhì)濃度(g/L)。原始數(shù)據(jù)記錄管號(hào)標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定管空白管1234567A值0.000日期，室溫實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)報(bào)告1、實(shí)