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《western blot操作規(guī)程-相關(guān)試劑配制》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、8SDS-PAGE電泳適用與Bio-RadMiniProtean3類電泳槽一、準(zhǔn)備工作1試劑蛋白marker；丙烯酰胺；雙丙烯酰胺；Tris堿；甘氨酸；甲醇；冰乙酸SDS；過硫酸銨；甘油；溴酚藍(lán)；β-巰基乙醇；考馬斯亮藍(lán)R-250；TEMED；正丁醇2儀器與耗材電泳系統(tǒng)；移液槍；電子天平；pH計(jì)；恒溫加熱器；EP試管；量筒（500ml,250ml,100ml,20ml）；燒杯（500ml,50ml）；玻璃引流棒；儲(chǔ)液瓶；二、操作步驟a.灌制分離膠(6cm×8cm×1.5mm):1.組裝好凝膠模具，確保不會(huì)發(fā)生凝膠滲漏。2.凝膠配制所用組分如下：按10
2、%配制配制Separatinggel所需各成分的體積/mL15%12%10%2gels1gel2gels1gel2gels1gel30%acrylamidemix105846.663.331.5MTri,pH8.852.552.552.5ddH2O4.82.46.83.48.044.0210%SDS0.20.10.20.10.20.110%APS0.10.050.10.050.10.05100%TEMED0.010.0050.010.0050.010.005Total201020102010（注：先加入，然后再從冰箱取出加入）3.加入APS和TEME
3、D后，輕輕振蕩燒杯使其混勻。（注：一定要將加入的溶液充分混勻，以免膠凝固的不均勻）4.小心地用移液器將分離膠沿隔片加入模具。（注：動(dòng)作緩慢，以免產(chǎn)生氣泡）5.當(dāng)加入的凝膠溶液7.4mL時(shí)，輕輕在溶液上覆蓋一層1mL正丁醇飽和的水，使膠面平整。6.等40min，待凝膠聚合后，在分離膠和水之間會(huì)出現(xiàn)一個(gè)清晰的界面。（注：此時(shí)可制備蛋白樣品。具體見“c.樣品的制備”）b.灌制濃縮膠1.濃縮膠配制所需組分如下：按3.9%配制配制Stackinggel所需各成分的體積/mL5%3.9%2gels1gel2gels1gel30%acrylamidemix1.70
4、.851.30.650.5MTri,pH6.82.51.252.51.25ddH2O5.72.856.13.0510%SDS0.10.050.10.0510%APS0.050.0250.050.025100%TEMED0.010.0050.010.005Total1051052.倒出并用濾紙吸干覆蓋在分離膠表面的水層。（注：先加入，然后倒出水，最后再從冰箱取出加入）3.加入APS和TEMED后，輕輕振蕩燒杯使其混勻。4.小心地用移液器將濃縮膠沿隔片加入模具，直至凝膠到達(dá)模具的頂部。5.斜著插上梳子。（注：動(dòng)作緩慢，盡量不要產(chǎn)生氣泡）6.放置30min
5、左右，待凝膠聚合后，小心拔出梳子。（注：拔出梳子時(shí)，要垂直撥出，以免損壞制好的泳道）7.將凝膠放入電泳槽中，在槽中加入1×電泳緩沖液。（注：1，緩沖液所加入的量，玻璃內(nèi)液面高于玻璃外液面，玻璃內(nèi)的，液面高于短玻璃低于長玻璃。2，盡量吸盡玻璃內(nèi)液面的氣泡，以免電泳過程中造成短路）c.樣品的制備：1.將蛋白樣品和samplebuffer在一1.5mL管中混勻，于95℃加熱5min（或100℃3min）。2.離心1sec，點(diǎn)樣入泳道。d.電泳：1.接好電極，電流應(yīng)流向陽極。2.150V恒壓電泳，直至染料前沿遷移至凝膠底部1～5mm處終止。時(shí)間約60-75m
6、in。（注：此時(shí)配制電轉(zhuǎn)緩沖液，剪NC膜和濾紙）3.取出凝膠板，小心拆卸。e.染色與脫色：（注：此步驟按實(shí)驗(yàn)需要選擇是否操作）考馬斯亮藍(lán)染色：1.戴上手套以免手指印留在膠上，將膠移入考馬斯亮藍(lán)溶液中，于振蕩搖床上緩緩振蕩染色2h以上（一般3～4h），染色和脫色過程中要用蓋子或封口膜密閉容器。2.加入考馬斯亮藍(lán)脫色液，振蕩脫色。Westernblot操作過程一、準(zhǔn)備工作：1試劑：Tris堿；甘氨酸；甲醇；預(yù)染marker(PRO-STAINTMPrestainedProteinMarkerⅠ,mbi)Whatman濾紙（普通實(shí)驗(yàn)室用的不行，要厚的，夾膜
7、用的）一抗；二抗；Western試劑盒(170-5013,Bio-Rad)；硝化纖維膜(Amersham)；X光片(最好是柯達(dá)的)；顯影粉（國產(chǎn)，洗普通照片的即可）；定影粉（國產(chǎn)，洗普通照片的即可）；2儀器及耗材：膜標(biāo)記筆；電轉(zhuǎn)系統(tǒng)；冷卻系統(tǒng)；磁力攪拌器；水平脫色搖床；錐型瓶（50ml,2個(gè)）；托盤；保鮮膜；二、操作步驟（除非特別提到，以下操作均在室溫水平搖床上緩緩振蕩進(jìn)行）：1.SDS-PAGE變性電泳；2.電轉(zhuǎn)移：a．將電轉(zhuǎn)用到的膜和濾紙（1張膜+6張濾紙/一塊膠）浸泡在電轉(zhuǎn)緩沖液中10min。（注：此時(shí)將分離膠從玻璃板中取出并浸泡到電轉(zhuǎn)緩沖液中
8、）b．按3張濾紙—膠—膜—3張濾紙的順序包好，并將濾紙四邊按膠的大小剪掉，確保膠兩邊的濾紙無法接觸到。C．將
