GBT27981-2011 牛傳染性鼻氣管炎病毒實時熒光PCR檢測方法.pdf

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1、ICS11.220B41瘩臼中華人民共和國國家標準GB/T27981~2011牛傳染性鼻氣管炎病毒實時2011-12-30發(fā)布熒光PCR檢測方法Real—timePCRmethodforthedetectionofinfectiousbovinerhinotracheitisvirus2012-06-01實施宰瞀徽紫瓣訾矬瞥星發(fā)布中國國家標準化管理委員會僅1”標準分享網(wǎng)www.bzfxw.com免費下載刖昌GB/T27981—2011本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準參考了OIE發(fā)布的《陸生動

2、物診斷試驗和疫苗手冊}(2008版)關于牛傳染性鼻氣管炎/牛傳染性化膿性外陰陰道炎(Chapter2.4.13)的內(nèi)容。本標準由全國動物防疫標準化技術委員會(SAC/TC181)歸口。本標準起草單位:中華人民共和國廣東出入境檢驗檢疫局、中華人民共和國江蘇出入境檢驗檢疫局。本標準主要起草人:陳茹、劉中勇、林志雄、羅瓊、曾碧健、許如蘇、姜焱,吳曉薇。標準分享網(wǎng)www.bzfxw.com免費下載1范圍牛傳染性鼻氣管炎病毒實時熒光PCR檢測方法GB/T27981—2011本標準規(guī)定了牛傳染性鼻氣管炎病毒(牛皰疹病毒I型,B

3、oHV一1)實時熒光PCR檢測方法的技術要求。本標準適用于快速檢測牛血樣、拭子、精液、動物組織(粘膜、肝、脾,腎、淋巴結、胎盤組織等)和細胞培養(yǎng)物等樣品中BoHV-1病毒感染。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注B期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適甩于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法世界動物衛(wèi)生組織(OIE)《陸生動物診斷試驗和疫苗標準手冊》(2008版)關于檢測牛冷凍精液中BoHV-1病毒的實時熒光PCR方

4、法3縮略語下列縮略語適用于本文件。BoHV-I:bovineherpesvirustypel,牛痘疹病毒I型。ct值:熒光信號量達到設定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。DNA:deoxyribonucleicacid,脫氧核糖核酸。DTT:DL-dithiothreitol,二硫蘇糖醇。EDTA:ethylenediaminetetraaceticacid,乙二胺四乙酸。IBR:bovineinfectiousrhinotracheitis,牛傳染性鼻氣管炎。PBS:phosphatebuffersolution,磷酸鹽緩

5、沖生理鹽水。PCR:polymerasechainreaction,聚合酶鏈式反應。SDS:sodiumdodecylsulfate,十二烷基磺酸鈉。UDG酶:uracilDNAglycosylase,尿嘧啶DNA糖基化酶。4設備和器材4.1熒光PCR儀。4.2臺式冷凍離心機。4。3可調(diào)微量移液器:規(guī)格10嚴L、100pL、200pL、1mL。4.4帶濾芯微量吸頭:規(guī)格lopL、100pL、200,uL、1mL。4,5PCR光學反應管。4.6微量離心管。4.7渦旋混勻器。4.8恒溫培養(yǎng)箱。4.9冰箱:規(guī)格2℃~8℃

6、,--20℃,--80℃。標準分享網(wǎng)www.bzfxw.com免費下載GB/T27981—20114.10恒溫水浴箱。5試劑除另有規(guī)定,本方法試驗用水應按照GB/T6682中規(guī)定的二級水,所用化學試劑均為分析純。5.1引物與探針引物與探針配制采用無DNA酶、無RNA酶水將每條引物與探針配制成100btmol/L儲存液,置--20℃或更低溫度凍存;使用時取適量配制成10Fmol/L工作液,避免多次凍融。引物與探針序列:gB基因上游引物gB-F:5’TGTGGACCTAAACCTCACGGT3’gB基因下游引物gB-R

7、:5’GTAGTCGAGCAGACCCGTGTC3’gB基因探針:5’[FAM]一AGGACCGCGAGTTcTTGCCGCEBHQl]3’探針5’端標記的報告熒光基團及3’端標記的淬滅基團可根據(jù)熒光PCR儀設備等具體情況另行選定。5.2蛋白酶K溶液:配制方法見附錄A。5.3檸檬酸鈉緩沖液:配制方法見附錄A。5.40.5mol/LEDTA:配制方法見附錄A。5.50.01mol/LpH7.2PBS:配制方法見附錄A。5.610%chelex100:配制方法見附錄A。5.7lmol/LDTT:配制方法見附錄A。5.8

8、2×定量PCR—UDG酶預混液:含60U/mL熱啟動Taq酶,40mmol/LTr碡HCl(pH8.4),100mmol/LKCI,6mmol/LMgClz,400btmol/LdGTP,400omol/LdATP,400/zmol/LdCTP,800/zmol/LdUTP,40U/mLUDG??刹捎媒?jīng)驗證可靠的商品化預混液。5.9核酸抽提試劑盒。5.10無

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