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《GBT27981-2011 牛傳染性鼻氣管炎病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法.pdf》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、ICS11．220B41瘩臼中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB／T27981～2011牛傳染性鼻氣管炎病毒實(shí)時(shí)2011-12-30發(fā)布熒光PCR檢測(cè)方法Real—timePCRmethodforthedetectionofinfectiousbovinerhinotracheitisvirus2012-06-01實(shí)施宰瞀徽紫瓣訾矬瞥星發(fā)布中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)僅1”標(biāo)準(zhǔn)分享網(wǎng)www.bzfxw.com免費(fèi)下載刖昌GB／T27981—2011本標(biāo)準(zhǔn)按照GB／T1．1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)參考了OIE發(fā)布的《陸生動(dòng)
2、物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè)}(2008版)關(guān)于牛傳染性鼻氣管炎／牛傳染性化膿性外陰陰道炎(Chapter2．4．13)的內(nèi)容。本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)動(dòng)物防疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC／TC181)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中華人民共和國(guó)廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局、中華人民共和國(guó)江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：陳茹、劉中勇、林志雄、羅瓊、曾碧健、許如蘇、姜焱，吳曉薇。標(biāo)準(zhǔn)分享網(wǎng)www.bzfxw.com免費(fèi)下載1范圍牛傳染性鼻氣管炎病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法GB／T27981—2011本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了牛傳染性鼻氣管炎病毒(牛皰疹病毒I型，B
3、oHV一1)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于快速檢測(cè)牛血樣、拭子、精液、動(dòng)物組織(粘膜、肝、脾，腎、淋巴結(jié)、胎盤組織等)和細(xì)胞培養(yǎng)物等樣品中BoHV-1病毒感染。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注B期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適甩于本文件。GB／T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)》(2008版)關(guān)于檢測(cè)牛冷凍精液中BoHV-1病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR方
4、法3縮略語下列縮略語適用于本文件。BoHV-I：bovineherpesvirustypel，牛痘疹病毒I型。ct值：熒光信號(hào)量達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。DNA：deoxyribonucleicacid，脫氧核糖核酸。DTT：DL-dithiothreitol，二硫蘇糖醇。EDTA：ethylenediaminetetraaceticacid，乙二胺四乙酸。IBR：bovineinfectiousrhinotracheitis，牛傳染性鼻氣管炎。PBS：phosphatebuffersolution，磷酸鹽緩
5、沖生理鹽水。PCR：polymerasechainreaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。SDS：sodiumdodecylsulfate，十二烷基磺酸鈉。UDG酶：uracilDNAglycosylase，尿嘧啶DNA糖基化酶。4設(shè)備和器材4．1熒光PCR儀。4．2臺(tái)式冷凍離心機(jī)。4。3可調(diào)微量移液器：規(guī)格10嚴(yán)L、100pL、200pL、1mL。4．4帶濾芯微量吸頭：規(guī)格lopL、100pL、200,uL、1mL。4，5PCR光學(xué)反應(yīng)管。4．6微量離心管。4．7渦旋混勻器。4．8恒溫培養(yǎng)箱。4．9冰箱：規(guī)格2℃～8℃
6、，--20℃，--80℃。標(biāo)準(zhǔn)分享網(wǎng)www.bzfxw.com免費(fèi)下載GB／T27981—20114．10恒溫水浴箱。5試劑除另有規(guī)定，本方法試驗(yàn)用水應(yīng)按照GB／T6682中規(guī)定的二級(jí)水，所用化學(xué)試劑均為分析純。5．1引物與探針引物與探針配制采用無DNA酶、無RNA酶水將每條引物與探針配制成100btmol／L儲(chǔ)存液，置--20℃或更低溫度凍存；使用時(shí)取適量配制成10Fmol／L工作液，避免多次凍融。引物與探針序列：gB基因上游引物gB-F：5’TGTGGACCTAAACCTCACGGT3’gB基因下游引物gB-R
7、：5’GTAGTCGAGCAGACCCGTGTC3’gB基因探針：5’[FAM]一AGGACCGCGAGTTcTTGCCGCEBHQl]3’探針5’端標(biāo)記的報(bào)告熒光基團(tuán)及3’端標(biāo)記的淬滅基團(tuán)可根據(jù)熒光PCR儀設(shè)備等具體情況另行選定。5．2蛋白酶K溶液：配制方法見附錄A。5．3檸檬酸鈉緩沖液：配制方法見附錄A。5．40．5mol／LEDTA：配制方法見附錄A。5．50．01mol／LpH7．2PBS：配制方法見附錄A。5．610％chelex100：配制方法見附錄A。5．7lmol／LDTT：配制方法見附錄A。5．8
8、2×定量PCR—UDG酶預(yù)混液：含60U／mL熱啟動(dòng)Taq酶，40mmol／LTr碡HCl(pH8．4)，100mmol／LKCI，6mmol／LMgClz，400btmol／LdGTP，400omol／LdATP，400／zmol／LdCTP，800／zmol／LdUTP，40U／mLUDG。可采用經(jīng)驗(yàn)證可靠的商品化預(yù)混液。5．9核酸抽提試劑盒。5．10無
