石蠟切片VS冰凍切片

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1、石蠟切片VS冰凍切片石蠟切片不僅用于觀察正常細胞組織的形態(tài)結構，也是病理學和法醫(yī)學等學科用以研究、觀察及判斷細胞組織的形態(tài)變化的主要方法，而且也已相當廣泛地用于其他許多學科領域的研究中。?冰凍切片是一種在低溫條件下使組織快速冷凍到一定的硬度，然后進行切片的一種方法。制作過程較石蠟切片快捷、簡便，因而多應用于手術中的快速病理診斷。石蠟切片冷凍切片應用對象廣泛應用常規(guī)制片手術中的快速病理診斷保持時間持久保存保存時間較短優(yōu)點1、細胞定位準確2、組織細胞形態(tài)結構保存完好3、保存時可放在室溫下保存1、簡便。2、快速，用時短3、組織變化不大4、能很好的保存脂肪、類脂等成分5、較好的保存抗原活性及酶類。

2、缺點1、步驟繁多，制片中抗原活性有所降低1、不易做連續(xù)切片2、切取的組織不能過大實驗步驟一、石蠟切片1.?固定：將新鮮組織切成小塊，固定于4%多聚甲醛過夜。凝固組織中的物質成分，盡可能保持其活體時的結構。同時能使組織硬化，有利于切片的進行。2.脫水：為了減少組織材料的急劇收縮，應使用從低濃度到高濃度遞增的順序進行經70%、85%、95%直至純酒精（無水乙醇），每次時間為1小時。固定后的組織材料需除去留在組織內的固定液及其結晶沉淀，否則會影響后期的染色效果。3.透明：常用的透明劑有二甲苯，二甲苯是石蠟的溶劑。純酒精不能與石蠟相溶，還需用能與酒精和石蠟相溶的溶劑，替換出組織內的酒精。材料塊在透

3、明劑浸漬過程稱透明。?4.浸蠟：先把組織材料塊放在熔化的石蠟和二甲苯的等量混合液浸漬1小時。先后移入2個熔化的石蠟液中浸漬1小時左右。5.包埋：以少許熱蠟液將其底部迅速貼附于包埋盒內上，然后置于速凍臺，讓石蠟固定。6.切片：正德利用厚生惟和切片刀的銳利與否、蠟塊硬度是否適當都直接影響切片質量，可將蠟塊至于冷水中改變蠟塊硬度。通常切片厚度為3-5um，用毛筆輕托輕放在37度水浴中展片。7.貼片與烤片：一般使用恒溫水浴鍋，溫度控制在37-40℃左右，有利于石蠟切片的展開，貼好的切片置于60℃恒溫箱內干燥2小時，蛋白質凝固后即可染色。8.切片脫蠟及水化：干燥后的切片置于二甲苯中進行脫蠟，然后依次

4、使用從高濃度到低濃度遞減的順序進行經純酒精、95%、85%、70%進行水化。9.染色：經典的蘇木精和伊紅：細胞核被蘇木精染成紫藍色，多數細胞質及非細胞成分被伊紅染成粉紅色。實驗操作簡單。免疫組化：指帶顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學的呈色反應。二、冰凍切片1.取材：應盡可能快地采取新鮮的材料，防止組織發(fā)生死后變化。2.速凍：1）將組織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內（直徑約2cm）。2）如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒組織，然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內。?3）當盒底部接觸液氮時即開始氣化沸騰，此時小盒保持原位切勿浸入液氮中，大約10-20s組織即迅速

5、冰結成塊。4）在制成凍塊后，即可置入恒冷箱切片機冰凍切片。5）若需要保存，應快速以鋁箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?.固定：1）樣品托上涂一層OCT包埋膠，將速凍組織置于其上，4℃冰箱預冷5-10min讓OCT膠浸透組織。2）取下組織置于錫箔或者玻片上，樣品托速凍。3）組織置于樣品托上，其上再添一層OCT膠，以完全覆蓋為宜，速凍架（PE）上30min。4.切片：1）恒溫冰凍切片機為較理想的冰凍切片機，其基本結構是將切片機置于低溫密閉室內，故切片時不受外界溫度和環(huán)境影響，可連續(xù)切薄片至5-10μm。2）切片時，低溫室內溫度以-15℃~?-20℃為宜，溫度過低組織易破碎，抗卷

6、板的位置及角度要適當，載玻片附貼組織切片，切勿上下移動。5.免疫熒光染色：1）冰凍切片室溫晾干15min，可用含10%正常山羊血清的PBS室溫封閉切片1小時（此步可不洗）。?2）滴加適當比例稀釋的一抗或一抗工作液（抗體的量視組織大小而定，原則是可以均勻覆蓋組織面，且保證整個過程中不會使組織干涸）。3）將切片放在加了PBS的免疫組化濕盒，室溫孵育2小時或4℃過夜。4）第二天先將濕盒放到37℃回溫1h，然后吸取片上的一抗進行回收，將切片插入到小染缸PBS沖洗。正德利用厚生惟和5）滴加用PBS稀釋好的二抗（避光）置于分子雜交箱中37℃孵育1小時?；厥斩梗衅糜谌靖變?，PBS洗5min×3次。

7、6）滴加DAPI工作液染核，室溫10-20min（工作濃度0.1%染色15min）。7）回收DAPI，滴加5-10μl抗熒光衰減封片劑或中性樹膠，用處理干凈的蓋玻片封片，即可到熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下觀察拍照。8）做好的切片放在切片盒內，置于4℃冰箱，可保存一周左右。常見問題及解決方案1.切片上卷且不能形成連續(xù)蠟帶原因：①切片刀不夠鋒利。②切片刀與蠟快的角度不當。③蠟塊四周留蠟邊太少。④石蠟硬度過大，黏度不夠。解決方