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《非受體酪氨酸激酶c-Abl抑制劑誘導(dǎo)線粒體損傷并抑制線粒體自噬》由會員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、萬方數(shù)據(jù)獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知,除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外,論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果,也不包含為獲得安徽大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名:諦鹼穗簽字日期:加Iy年}月刁日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解安徽大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定,有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤,允許論文被查閱和借閱
2、。本人授權(quán)安徽大學(xué)可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索,可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。(保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書)學(xué)位論文作者簽名:誘時紛君簽字日期:2.o1,年s月司日鋤鮐。帚噼簽字日期:,d---、,一r年廠月三7日萬方數(shù)據(jù)摘要摘要c.Abl(cellularAbelsongeneproduct,c—Abl)是非受體酪氨酸激酶超家族Abelson的成員,在細(xì)胞生長和生存的許多重要信號通路,如細(xì)胞骨架重塑、細(xì)胞遷移和粘附、受體內(nèi)吞作用、自噬、DNA損傷反應(yīng)和細(xì)胞凋亡、促進(jìn)自噬
3、體進(jìn)入溶酶體以及溶酶體組件的正常工作等方面都有重要作用。受到氧化壓力刺激,c.Abl進(jìn)入線粒體可以介導(dǎo)線粒體功能損傷和細(xì)胞死亡。正常情況下,細(xì)胞內(nèi)c.Abl活性比較低,電離輻射或氧化應(yīng)激時被激活。由于染色體易位形成BCR.Abl融合基因,其編碼的BCR—ABL融合蛋白呈組成性激活狀態(tài),是導(dǎo)致慢性粒細(xì)胞性白血病(CML)的主要原因。c—Abl的抑制劑STl571(又稱伊馬替尼,格列衛(wèi))是90年代開發(fā)的酪氨酸激酶4qlN齊,J類藥物,是全世界第一個靶向小分子藥物,在BCR.Abl陽性急、慢性白血病的治療中發(fā)揮了重要作用。持續(xù)使用該
4、藥的病人,其預(yù)期壽命己與正常人群沒有顯著區(qū)別。有文獻(xiàn)中己經(jīng)報道STl571可以升高細(xì)胞的活性氧水平,同時將表皮生長因子抑制劑聯(lián)合STl571用藥可協(xié)同促進(jìn)tEtJ,細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡。線粒體是真核細(xì)胞氧化產(chǎn)能的重要場所,它通過內(nèi)膜上的呼吸鏈復(fù)合物之間的協(xié)作,氧化還原呼吸作用底物并耦合電子傳遞產(chǎn)生ATP。在線粒體和亞線粒體顆粒以及完整的細(xì)胞中,呼吸作用除了可以維持細(xì)胞正常代謝之外,不可避免會產(chǎn)生一些活性氧族如H202、超氧陰離子、氫自由基及羥基自由基。特別是當(dāng)線粒體呼吸作用受到抑制或者功能紊亂時,會大量產(chǎn)生活性氧族。線粒體產(chǎn)生的活
5、性氧族對細(xì)胞會產(chǎn)生毒性,誘使細(xì)胞死亡。線粒體受到損傷后,其表面蛋白會被泛素修飾,并與溶酶體融合,以清除受損傷的線粒體,該過程被稱為線粒體自噬(Mitophagy)a凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducingfactor,AIF)定位于線粒體內(nèi)膜上,是呼吸鏈復(fù)合物I的組成部分,具有維持線粒體穩(wěn)態(tài)和促凋亡雙重作用。正常生理條件下,AIF作為依賴于NADH的氧化還原酶,參與呼吸作用;當(dāng)線粒體受損時,AIF經(jīng)特定蛋白酶切割,從線粒體內(nèi)膜脫離并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核,引發(fā)染色體凝聚和DNA片段化,從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但是AIF對細(xì)胞內(nèi)ROS
6、的產(chǎn)生及線粒體自噬的關(guān)系尚無相關(guān)報道。萬方數(shù)據(jù)非受體酪氨酸激酶c—Abl抑制劑誘導(dǎo)線粒體損傷并抑制線粒體自噬實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果已證實(shí)c.Abl能夠與AIF相互作用,且導(dǎo)致AIF磷酸化。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上,首先通過免疫共沉淀,純化在c—Abl表達(dá)細(xì)胞中表達(dá)的Flag.AIF,SDS.PAGE電泳分離出AIF蛋白,切取含有AIF的蛋白膠塊,通過LC.MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜鑒定,發(fā)現(xiàn)AIF蛋白的Y170和Y253可以被磷酸化。為進(jìn)一步研究c.Abl對AIF的Y170和Y253位點(diǎn)的特異性磷酸化,針對Y170和Y253這兩個酪氨酸磷
7、酸化位點(diǎn),我們合成了磷酸化的多肽,通過免疫家兔制備了相應(yīng)的位點(diǎn)特異性磷酸化抗體,AIF.Y(170).P—Tyr和AIF.Y(253).P.Tyr。通過Y(170F)、Y(253F)單一突變體和Y(170253F)雙突變體的免疫印記實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證這兩個位點(diǎn)的特異性磷酸化。為研究c.Abl磷酸化AIF的生物學(xué)意義,我們設(shè)計并合成干擾AIF基因表達(dá)的siRNA序列,經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝、轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中,用嘌呤霉素篩選出基因組整合有干擾序列siRNA的陽性克隆株,并通過免疫印記驗(yàn)證,AIF基因表達(dá)水平降低80%以上,成功構(gòu)建了A
8、IF敲低的A549穩(wěn)定細(xì)胞系。采用免疫熒光技術(shù),綠色熒光二抗FITC標(biāo)記AIF,紅色Mitotrackerred染料標(biāo)記線粒體,在鏡下觀察發(fā)現(xiàn)AIF敲低的線粒體有片段化損傷現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果己證實(shí)c.Abl抑制劑STl571能夠造成線粒體損傷,進(jìn)一步研究這一現(xiàn)象,我們發(fā)