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《非受體酪氨酸激酶c-Abl抑制劑誘導(dǎo)線粒體損傷并抑制線粒體自噬》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、萬方數(shù)據(jù)獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得安徽大學(xué)或其他教育機構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名：諦鹼穗簽字日期：加Iy年}月刁日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解安徽大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱
2、。本人授權(quán)安徽大學(xué)可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。(保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書)學(xué)位論文作者簽名：誘時紛君簽字日期：2．o1，年s月司日鋤鮐。帚噼簽字日期：,d---、，一r年廠月三7日萬方數(shù)據(jù)摘要摘要c．Abl(cellularAbelsongeneproduct，c—Abl)是非受體酪氨酸激酶超家族Abelson的成員，在細胞生長和生存的許多重要信號通路，如細胞骨架重塑、細胞遷移和粘附、受體內(nèi)吞作用、自噬、DNA損傷反應(yīng)和細胞凋亡、促進自噬
3、體進入溶酶體以及溶酶體組件的正常工作等方面都有重要作用。受到氧化壓力刺激，c．Abl進入線粒體可以介導(dǎo)線粒體功能損傷和細胞死亡。正常情況下，細胞內(nèi)c．Abl活性比較低，電離輻射或氧化應(yīng)激時被激活。由于染色體易位形成BCR．Abl融合基因，其編碼的BCR—ABL融合蛋白呈組成性激活狀態(tài)，是導(dǎo)致慢性粒細胞性白血病(CML)的主要原因。c—Abl的抑制劑STl571(又稱伊馬替尼，格列衛(wèi))是90年代開發(fā)的酪氨酸激酶4qlN齊,J類藥物，是全世界第一個靶向小分子藥物，在BCR．Abl陽性急、慢性白血病的治療中發(fā)揮了重要作用。持續(xù)使用該
4、藥的病人，其預(yù)期壽命己與正常人群沒有顯著區(qū)別。有文獻中己經(jīng)報道STl571可以升高細胞的活性氧水平，同時將表皮生長因子抑制劑聯(lián)合STl571用藥可協(xié)同促進tEtJ,細胞肺癌細胞凋亡。線粒體是真核細胞氧化產(chǎn)能的重要場所，它通過內(nèi)膜上的呼吸鏈復(fù)合物之間的協(xié)作，氧化還原呼吸作用底物并耦合電子傳遞產(chǎn)生ATP。在線粒體和亞線粒體顆粒以及完整的細胞中，呼吸作用除了可以維持細胞正常代謝之外，不可避免會產(chǎn)生一些活性氧族如H202、超氧陰離子、氫自由基及羥基自由基。特別是當線粒體呼吸作用受到抑制或者功能紊亂時，會大量產(chǎn)生活性氧族。線粒體產(chǎn)生的活
5、性氧族對細胞會產(chǎn)生毒性，誘使細胞死亡。線粒體受到損傷后，其表面蛋白會被泛素修飾，并與溶酶體融合，以清除受損傷的線粒體，該過程被稱為線粒體自噬(Mitophagy)a凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducingfactor，AIF)定位于線粒體內(nèi)膜上，是呼吸鏈復(fù)合物I的組成部分，具有維持線粒體穩(wěn)態(tài)和促凋亡雙重作用。正常生理條件下，AIF作為依賴于NADH的氧化還原酶，參與呼吸作用；當線粒體受損時，AIF經(jīng)特定蛋白酶切割，從線粒體內(nèi)膜脫離并轉(zhuǎn)移到細胞核，引發(fā)染色體凝聚和DNA片段化，從而誘導(dǎo)細胞凋亡。但是AIF對細胞內(nèi)ROS
6、的產(chǎn)生及線粒體自噬的關(guān)系尚無相關(guān)報道。萬方數(shù)據(jù)非受體酪氨酸激酶c—Abl抑制劑誘導(dǎo)線粒體損傷并抑制線粒體自噬實驗室前期研究結(jié)果已證實c．Abl能夠與AIF相互作用，且導(dǎo)致AIF磷酸化。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，首先通過免疫共沉淀，純化在c—Abl表達細胞中表達的Flag．AIF，SDS．PAGE電泳分離出AIF蛋白，切取含有AIF的蛋白膠塊，通過LC．MS／MS串聯(lián)質(zhì)譜鑒定，發(fā)現(xiàn)AIF蛋白的Y170和Y253可以被磷酸化。為進一步研究c．Abl對AIF的Y170和Y253位點的特異性磷酸化，針對Y170和Y253這兩個酪氨酸磷
7、酸化位點，我們合成了磷酸化的多肽，通過免疫家兔制備了相應(yīng)的位點特異性磷酸化抗體，AIF．Y(170)．P—Tyr和AIF．Y(253)．P．Tyr。通過Y(170F)、Y(253F)單一突變體和Y(170253F)雙突變體的免疫印記實驗，驗證這兩個位點的特異性磷酸化。為研究c．Abl磷酸化AIF的生物學(xué)意義，我們設(shè)計并合成干擾AIF基因表達的siRNA序列，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝、轉(zhuǎn)染到A549細胞中，用嘌呤霉素篩選出基因組整合有干擾序列siRNA的陽性克隆株，并通過免疫印記驗證，AIF基因表達水平降低80％以上，成功構(gòu)建了A
8、IF敲低的A549穩(wěn)定細胞系。采用免疫熒光技術(shù)，綠色熒光二抗FITC標記AIF，紅色Mitotrackerred染料標記線粒體，在鏡下觀察發(fā)現(xiàn)AIF敲低的線粒體有片段化損傷現(xiàn)象。實驗室前期研究結(jié)果己證實c．Abl抑制劑STl571能夠造成線粒體損傷，進一步研究這一現(xiàn)象，我們發(fā)
