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《慢病毒包裝、濃縮、純化、滴度實(shí)驗(yàn)步驟》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、一、包裝細(xì)胞293T細(xì)胞的培養(yǎng)一、293T細(xì)胞的凍存1.隨著傳代的次數(shù)增加，293T細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)狀態(tài)下降，出現(xiàn)突變等。所以要在細(xì)胞購(gòu)進(jìn)時(shí)就進(jìn)行凍存。2.在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行凍存，增加細(xì)胞復(fù)蘇成活率。3.倒去細(xì)胞上清液，加入D-Hank's液洗去殘留的培養(yǎng)基。4.加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。5.鏡下觀察細(xì)胞變圓，細(xì)胞間間隙加大時(shí)，加入新鮮培養(yǎng)基吹打混勻。6.細(xì)胞計(jì)數(shù)。7.將細(xì)胞離心，1000rpm，2min。8.根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果加入細(xì)胞凍存液（70%完全培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO）重懸細(xì)胞，密度為3×106個(gè)/ml。10.第二天將細(xì)胞放入液氮灌，并
2、記錄。二、293T細(xì)胞的傳代1.當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合率達(dá)到80~90%需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代操作，以擴(kuò)大細(xì)胞數(shù)量，維持細(xì)胞良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。2.消化細(xì)胞，方法同上。3.細(xì)胞離心結(jié)束后，加入完全培養(yǎng)基重懸。密度為3×105個(gè)/ml。4.分到10cm培養(yǎng)皿中，10ml/皿。三、293T細(xì)胞的復(fù)蘇1.當(dāng)細(xì)胞傳代次數(shù)過(guò)多（超過(guò)50代），細(xì)胞狀態(tài)變差時(shí)或細(xì)胞出現(xiàn)污染事故時(shí)，需要丟棄并對(duì)開始凍存的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇。2.打開水浴鍋，設(shè)置溫度為40℃。3.查看細(xì)胞庫(kù)記錄，根據(jù)記錄從液氮灌中取出凍存的細(xì)胞（需戴上棉手套，防止被凍傷），迅速丟入水浴鍋中并快速晃動(dòng)，在1~2min內(nèi)使細(xì)胞溶液完全溶解。4.將
3、1ml細(xì)胞溶液加入9ml完全培養(yǎng)基中并混勻后轉(zhuǎn)入10cm培養(yǎng)皿。5.放回37℃、3%CO2和95%相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6.第二天觀察細(xì)胞存活率。倒掉舊的培養(yǎng)基，加入10ml新鮮培養(yǎng)基。二、慢病毒的包裝、濃縮和滴度測(cè)定1.所用病毒檢測(cè)引物為WPRE特異引物，序列如下5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3'(forwardprimer),5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3'(reverseprimer)and5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3'(probe)2.TaqManUniversalPCRMas
4、terMix(AppliedBiosystems，cat.no.4304437)3.TaqManDNATemplateReagentKit(AppliedBiosystems，cat.no.401970)4.TaqManRNasePcontrolreagent(AppliedBiosystems，cat.no.4316844)?用于包裝的293T細(xì)胞的培養(yǎng)用于包裝的293T細(xì)胞(ATCCNo.CRL-11268)必需選擇處于生長(zhǎng)旺盛期，細(xì)胞狀態(tài)較佳，存活率90%以上，細(xì)胞邊緣清晰，傳代次數(shù)較低。任何時(shí)候細(xì)胞匯合率都不準(zhǔn)達(dá)到100%。慢病毒的包裝1.預(yù)先準(zhǔn)備3個(gè)T150瓶的
5、293T細(xì)胞，培養(yǎng)基為DMEM+10%FBS，1%Glutamax，1%青霉素-鏈霉素。2.將細(xì)胞分到12分到12個(gè)T150瓶中，每瓶的細(xì)胞密度是8×106個(gè)。3.第二天，鏡下檢查細(xì)胞。細(xì)胞融合度應(yīng)大致為30-40%，分布均勻。4.轉(zhuǎn)染前1小時(shí)，取出細(xì)胞板，去除原有細(xì)胞培養(yǎng)基，加入20ml的Opti-MEM培養(yǎng)基，將細(xì)胞送回培養(yǎng)箱。5.取兩支無(wú)菌的50ml離心管，其中一支中加入252μgpNL-EGFP/CMV/WPREDU3載體質(zhì)粒，168μgpCD/NL-BH*DDD包裝質(zhì)粒和84μgpLTR-G質(zhì)粒，用Opti-MEM培養(yǎng)基補(bǔ)齊到18ml。另一支中加入500μlTr
6、ans-EZ溶液和17.5mlOpti-MEM培養(yǎng)基，用電動(dòng)移液器輕輕混勻。將Trans-EZ稀釋液滴加到質(zhì)粒管中，邊加邊輕輕晃勻。關(guān)鍵步驟：推薦使用Qiagen質(zhì)粒大抽試劑盒或相當(dāng)?shù)脑噭┖兴苽涞馁|(zhì)粒。6.室溫孵育20分鐘，使DNA和Trans-EZ充分結(jié)合形成轉(zhuǎn)染復(fù)合體。7.取1支5ml的移液管，將得到的DNA-Trans-EZ復(fù)合體均勻滴加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中，每板3ml。來(lái)回晃動(dòng)培養(yǎng)板，混勻后放回到5%二氧化碳培養(yǎng)箱。每一皿細(xì)胞培養(yǎng)盤不要超過(guò)6盤。8.6小時(shí)后，移去細(xì)胞上清，更換為17ml的DMEM完全培養(yǎng)基。9.轉(zhuǎn)染后一天觀察細(xì)胞，所有的細(xì)胞應(yīng)當(dāng)都是健康的并且密度接
7、近60-80%。如果所轉(zhuǎn)染質(zhì)粒帶有GFP熒光，那么這時(shí)候可以看到大于95%的細(xì)胞都是帶有熒光的。10.將細(xì)胞送回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2天（36-48小時(shí)）。在這個(gè)過(guò)程中，細(xì)胞會(huì)逐漸融合形成多核體，大多數(shù)的細(xì)胞依然貼壁。11.收集所有的上清，分裝到50ml離心管中。12.4℃，500g離心10分鐘，除去脫落的細(xì)胞和大的細(xì)胞碎片。13.總的上清約為204ml，用250-ml0.45μmPVDF過(guò)濾裝置過(guò)濾。如果發(fā)現(xiàn)濾膜被堵住，表現(xiàn)為過(guò)濾速度變慢，更換新的濾器。慢病毒的濃縮與純化方法一超速離心沉淀法1.取6個(gè)Ultra-clearSW28
