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1、細胞破碎技術第二章細胞破碎技術第一節(jié)細胞壁的結構與組成第二節(jié)細胞壁的破碎第三節(jié)包涵體第一節(jié)細胞壁的結構與組成細胞壁是微生物菌體比較復雜的結構。不僅取決于微生物的類型，還取決于培養(yǎng)發(fā)酵液的組成、細胞所處的生長階段、細胞的存儲方式以及其它一些因素。不同微生物菌體細胞壁的結構有一定差異。一、細菌細菌的細胞壁堅韌而有彈性，由不同的肽鏈結合組成質量均勻的網(wǎng)狀結構，其厚度因細菌不同而有差異，可抵御外界的機械損傷，并可承受細胞內強大的滲透壓而不被破壞。第一節(jié)細胞壁的結構與組成細胞壁的主要成份是肽聚糖，由N—乙酰葡糖胺（見圖2-1a）和N—乙酰胞壁酸（見圖2-1b）構
2、成雙糖單元，以β（1-4）糖苷鍵連接成大分子。N—乙酰胞壁酸分子上四肽側鏈，相鄰葡聚糖纖維之間的短肽通過肽橋或肽鍵連接起來，組成機械性很強的網(wǎng)狀結構，像膠合板一樣，粘合成多層。各種細菌細胞壁酞聚糖結構均相同，但在四肽側鏈的組成及其連接方式上隨菌種不同而有差異。革蘭氏陽性菌細胞壁（見圖2-2）較厚，約20～80nm。含15～50層肽聚糖片層，每層厚度1nm，約占細胞干重的50%～80%。此外，尚有壁磷壁酸和膜磷壁酸。第一節(jié)細胞壁的結構與組成圖2-1細菌細胞壁的主要組分第一節(jié)細胞壁的結構與組成革蘭氏陰性菌細胞壁（見圖2-3）細胞壁較薄，有1～2層肽聚糖片，
3、在肽聚糖層外尚有脂蛋白、脂質雙層、脂多糖三部分。脂蛋白的功能是將外膜固定于肽聚糖層，脂類和蛋白質等在穩(wěn)定細胞結構上非常重要，如果被抽提，細胞壁將變得很不牢固。第一節(jié)細胞壁的結構與組成二、真菌和酵母真菌的細胞壁含有幾丁質（N-乙酰葡萄糖胺的一種聚合物）纖維素、葡聚糖、甘露聚糖、半乳聚糖等。此外還有蛋白質、類脂、無機鹽等。而酵母的細胞壁（見圖2-4）由特殊的纖絲狀物質構成，主要成份是甘露聚糖（31%），葡聚糖（29%），蛋白質（13%）和類脂質（8.5%）。酵母中的葡聚糖的為β-1，6-葡聚糖通過β-1，3鍵與D-葡萄糖中第一側鏈交連而不溶于水。所有的真菌
4、細胞壁是由不同的多糖鏈相互纏繞成一股又粗又壯的鏈，嵌入在蛋白質及類脂和一些小分子的多糖基質中，看起來像鋼筋混凝土，從而解釋了真菌細胞壁的機械強度和硬度。第一節(jié)細胞壁的結構與組成三、藻類藻類的細胞壁更為復雜，其主要結構成份，是纖絲狀的多糖類物質。M-甘露聚糠；P-磷酸二脂鍵；G-葡聚糠圖2-4酵母細胞壁的結構示意圖第二節(jié)細胞壁的破碎細胞破碎的方法很多，在諸多破碎方法中，機械法中的球磨機和高壓勻漿機不僅在實驗室而且在工業(yè)得到應用。其它的方法大多尚停留在實驗室應用，工業(yè)化的應用還在探索之中。一、球磨法球磨機是破碎微生物細胞的常用設備，一般有立式（見圖2-5）
5、或臥式（見圖2-6）兩種，在磨腔中裝入小玻璃球或小鋼球，由電動機帶動攪拌碟片高速攪拌微生物細胞懸浮物和小磨球而產生剪切力，將細胞破碎。第二節(jié)細胞壁的破碎圖2-5NetzschMolinexKE5攪拌磨圖2-6NetzshLM20砂磨機第二節(jié)細胞壁的破碎破碎作用遵循一級動力學定律：（2-1）式中R——t時間內釋放的蛋白質數(shù)量（mg/g）；Rm——100%破碎細胞釋放的蛋白質數(shù)量（mg/g）。k——破碎的比速率，s-1；t——球磨機工作的時間，s。第二節(jié)細胞壁的破碎將上式由開始工作到t時刻積分，可得：（2-2）式中x——為R/Rm，t時刻釋放蛋白質的分數(shù)，
6、x數(shù)值越大，表示破碎程度越高。一般用破碎率Y表示破碎程度。破碎率定義為被破碎細胞的數(shù)量占原始細胞的百分數(shù)。第二節(jié)細胞壁的破碎式中N0——原始細胞數(shù)量；N——經(jīng)t時刻操作后保留下來的未受損害完整細胞的數(shù)量。N0和N可由直接計數(shù)法和間接法求得。直接計數(shù)法是直接對稀釋后的樣品用血球計數(shù)器或平板菌落計數(shù)法進行計數(shù)。間接計數(shù)法是在細胞破碎后，將懸浮液離心分離，除去細胞碎片，未破碎的細胞及其他懸浮物，然后對清液進行蛋白質含量或酶的活性進行分析。通過細胞釋放出來的化合物的量R與所有細胞理論最大釋放量Rm的比值R/Rm，求出破碎率。（2-3）第二節(jié)細胞壁的破碎破碎率是
7、選擇細胞破碎設備的重要依據(jù)之一。在用球磨法破碎細胞的過程中，影響因素有以下幾個方面：（1）攪拌器外緣速率攪拌器速度增加，剪切力增大，細胞破碎量增大，但是高的能量消耗，高的熱量產生和磨球的磨損以及因剪切力引起產物失活，因此對于給定處理量和對蛋白質的釋放要求下，存在著最佳效率點。實際生產中，攪拌器外緣速率控制在（5～15）m/s之間。第二節(jié)細胞壁的破碎（2）細胞的濃度在細胞破碎過程中，產生的熱量隨濃度的增大而提高，增加了冷卻的費用。因此最佳的細胞濃度由實驗來確定。用NetzshLM20研磨和破碎酵母或細菌時，細胞濃度控制在40%左右。（3）球粒大小和裝填量
8、磨球越小，細胞破碎速度越快。但磨球太小而漂浮，難以停留在磨腔中。因此實驗室規(guī)模的研磨機中，球徑
