核酸的分離純化1

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1、第一節(jié)核酸的分離純化第二節(jié)聚合酶鏈式反應（PCR）第三節(jié)凝膠電泳系統(tǒng)第四節(jié)核酸的分子雜交第五節(jié)核苷酸序列分析第六節(jié)基因工程第五章分子生物學實驗技術分子生物學研究之所以從20世紀中葉開始得到高速發(fā)展，其中最主要的原因就是現(xiàn)代分子生物學研究方法、特別是基因操作和基因工程技術的進步。DNA分子的切割與連接核酸分子雜交凝膠電泳細胞轉化核酸序列分析基因的人工合成基因操作基因的定點突變PCR擴增等核心技術基因工程誕生的基礎1、理論上的三大成就2、技術上的二大發(fā)明三大成就：1.40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質，解決了遺傳的物質基礎問題

2、；1928FrederickGriffith&1944OswaldAveryTransformationofStreptococcuspneumoniae1952年Hershey和Chase證實噬菌體DNA侵染細菌實驗2.50年代揭示了DNA分子的雙螺旋結構模型和半保留復制機制,解決了基因的自我復制和世代交替問題；X-raysourceCrystallizedDNARosalindFranklin拍出了第一張能反映DNA美麗雙螺旋結構的X射線照片MauriceWilkinsPhotographicfilm1953-Franklin&WilkinsDescriptio

3、nofthe3-DstructureofDNAFrancisCrick&JamesWatson三位科學家因為對這一成果的貢獻，共享1962年的諾貝爾生物學獎ConservativeModelSemiconservativeModelFrankStahlMattMeselsonParentcellFirstreplicationSecondreplication1958-MatthewMeselson&FranklinStahlprovedthatDNAreplicationinbacteriafollowsthesemiconservativepathway3.50

4、年代末至60年代，相繼提出了"中心法則"和操縱子學說,成功地破譯了遺傳密碼，充分認識了遺傳信息的流動和表達。JacobandMonod但是，如果沒有分離和富集單一DNA分子的技術，科學家就無法對這類物質進行直接的生化分析。兩大技術保證：1.DNA的體外切割和連接1962年Arber發(fā)現(xiàn)限制性核酸內切酶，1967Gellert發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶（DNAligase）一把特殊的剪刀—限制性內切酶的發(fā)現(xiàn)阿爾伯(Arber)、史密斯(Smith)和內森斯(Nathans)，獲1978年諾貝爾生理學和醫(yī)學獎HerbertBoyer,StanleyCohen1972年獲得第一

5、個重組DNA分子(實現(xiàn)不同來源DNA的重組)HerbertBoyer1972-PaulBergProducedfirstrecombinantDNAusingEcoRIEcoRIrecognitionsitesλphageDNAEcoRIcutsDNAintofragmentsStickyendSV40DNAThetwofragmentssticktogetherbybasepairingDNAligaseRecombinantDNA1973-Boyer,Cohen&ChangTransformE.coliwithrecombinantplasmidStanleyC

6、ohen&AnnieChanHerbertBoyerKanamycinresistancegenePlasmidpSC101TetracyclineresistancegeneE.colitransformedwithrecombinantplasmidTransformedcellsplatedontomediumwithkanamycinandtetracyclineOnlycellswithrecombinantplasmidsurvivetoproducecolonies2.DNA的核苷酸序列分析技術DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶學和生物化學的基礎上創(chuàng)立

7、并發(fā)站起來的一門重要的DNA技術學，這門技術，對于從分子水平上研究基因的結構與功能的關系，以及克隆DNA片斷的操作方面，都有著十分廣泛的使用價值。Generalprocessofgeneengineering1.從生物有機體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。2.將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復制的并具有選擇記號的載體分子上，形成重組DNA分子。3.將重組DNA分子轉移到適當?shù)氖荏w細胞（亦稱寄主細胞）并與之一起增殖。4.從大量的細胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細胞，并篩選出已經得到擴增的目的基因。5.將目的基因克隆到表達載體上