AFLP 分子標(biāo)記及其在茶樹(shù)遺傳育種中的應(yīng)用

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1、AFLP分子標(biāo)記及其在茶樹(shù)遺傳育種中的應(yīng)用研究生5班食品科學(xué)劉艷二、四、三、AFLP技術(shù)的原理和操作過(guò)程AFLP在茶樹(shù)遺傳育種上的應(yīng)用AFLP在茶樹(shù)育種上的應(yīng)用前景一、AFLP分子標(biāo)記技術(shù)的背景介紹AFLP背景介紹出現(xiàn)：AFLP(amplifiedfragmentlengthpolymorphism,AFLP)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性是一種選擇性擴(kuò)增限制性片段的方法,是一種實(shí)用的,有效的新的一種DNA分子標(biāo)記技術(shù),是由荷蘭Keygene公司科學(xué)家Zabeau和Vos發(fā)展起來(lái)的一種檢測(cè)DNA多態(tài)性的方法,1993年獲得歐洲專利局專利。該技術(shù)是繼RFLP、SSR和RAPD之后發(fā)

2、展起來(lái)的DNA指紋技術(shù)。用途：由于AFLP擴(kuò)增可使某一品種出現(xiàn)特定的DNA譜帶，而在另一品種中可能無(wú)此譜帶產(chǎn)生，因此，這種通過(guò)引物誘導(dǎo)及DNA擴(kuò)增后得到的DNA多態(tài)性可做為一種分子標(biāo)記。已廣泛用于基因鑒定、基因作圖、基因表達(dá)等方面,在茶樹(shù)遺傳育種研究領(lǐng)域也正在逐步拓展,具有較大的應(yīng)用潛力。被認(rèn)為是迄今為止最理想的一種DNA分子標(biāo)記技術(shù)之一.AFLP背景介紹RFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性）是第一代分子生物學(xué)標(biāo)記，主要包括以下基本步驟：DNA提取→用限制性內(nèi)切酶酶切DNA→用凝膠電泳分開(kāi)DN

3、A片段→把DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜上→利用放射性標(biāo)記的探針雜交顯示特定的DNA片段（Southern雜交）和結(jié)果分析。RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA）即隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記，RAPD是建立在PCR基礎(chǔ)之上的一種可對(duì)整個(gè)未知序列的基因組進(jìn)行多態(tài)性分析的分子技術(shù)，其基本原理與PCR技術(shù)一致。其以基因組DNA為模板，以單個(gè)人工合成的隨機(jī)多態(tài)核苷酸序列(通常為10個(gè)堿基對(duì))為引物，在熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(Taq酶)作用下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖或聚丙烯酰胺電泳分離、溴化乙錠染色后，在紫外透視儀上檢測(cè)多態(tài)性。擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性反映了

4、基因組的多態(tài)性。AFLP背景介紹AFLP優(yōu)點(diǎn)：DNA用量少、靈敏度高,不需要預(yù)先知道基因組的信息。一般一次反應(yīng)可得到50～150個(gè)擴(kuò)增片段,具有很高的可靠性,被認(rèn)為是效率最高的標(biāo)記。AFLP采用長(zhǎng)引物和更高的退火溫度進(jìn)行PCR,比RAPD等其他以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記具有更好的重復(fù)性。這種方法由于結(jié)合了RFLP和PCR的優(yōu)點(diǎn),既具有RFLP可靠性好、重復(fù)性高的特點(diǎn),同時(shí)又具有PCR的高效性、安全性和方便性的優(yōu)點(diǎn)。AFLP標(biāo)記所檢測(cè)的多態(tài)性本質(zhì)上與RFLP一致,但技術(shù)上卻簡(jiǎn)單的多,并且可以通過(guò)控制引物隨機(jī)核苷酸的種類和數(shù)目來(lái)調(diào)節(jié)AFLP產(chǎn)物的條帶的特異性和數(shù)量,因此能提

5、供較多的基因組多態(tài)性信息。AFLP基本原理AFLP是通過(guò)PCR反應(yīng)先把酶切片段擴(kuò)增:實(shí)驗(yàn)中酶切片段首先與含有與其共同粘性末端的人工接頭連接,連接后的粘末端順序和接頭順序就作為以后PCR反應(yīng)的引物結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)具體需要通過(guò)選擇在末端上分別添加了1-3個(gè)選擇性核苷酸的不同引物,這些選擇性核苷酸使引物能選擇性地識(shí)別具有特異配對(duì)順序的內(nèi)切酶片段并與之結(jié)合,實(shí)現(xiàn)選擇性擴(kuò)增。然后把擴(kuò)增的酶切片段在高分辨率的順序分析膠上進(jìn)行電泳,多態(tài)性即以擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度不同被檢測(cè)出來(lái)。AFLP技術(shù)流程圖AFLP技術(shù)流程1、模板DNA的制備2、DNA擴(kuò)增反應(yīng)3、擴(kuò)增產(chǎn)物的分離與檢測(cè)模板DNA的制備檢

6、測(cè)制備好待測(cè)DNA樣品經(jīng)過(guò)濃度和質(zhì)量,用具有6個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)通常是EcoRI(G/AATTC)和4個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)的MseI(T/TAA)兩種內(nèi)切酶進(jìn)行酶切,形成三種類型的酶切片段。DNA酶切完成后,經(jīng)加熱讓限制性內(nèi)切酶失活,酶切片段在T4連接酶的作用下與兩種內(nèi)切酶相應(yīng)的特定接頭相連接,形成帶接頭的特異性片段，作為擴(kuò)增反應(yīng)的模板。模板DNA的制備用于限制性片段切割的二種酶，一種是罕見(jiàn)切割酶，一種是常用切割酶。AFLP的接頭是一種人工合成的雙鏈DNA,長(zhǎng)度一般為14～18個(gè)核苷酸,由核心序列和內(nèi)切酶位點(diǎn)特異序列兩部分組成。由于EcoRI酶切可以產(chǎn)生小片段DNA便于擴(kuò)增,M

7、seⅠ酶切可以產(chǎn)生小而穩(wěn)定的酶切片段,因此,目前EcoRI接頭和MseⅠ接頭已廣泛應(yīng)用于AFLP多態(tài)性分析中。DNA擴(kuò)增反應(yīng)以酶切后連接產(chǎn)物作為模板,用人工合成的選擇性單鏈寡核苷酸作為引物，在Taq聚合酶的作用下，完成AFLP的選擇性擴(kuò)增。酶切片段要經(jīng)過(guò)連續(xù)兩次PCR擴(kuò)增。預(yù)擴(kuò)增采用含有一個(gè)選擇性堿基或不含選擇性堿基的引物進(jìn)行。目的：為了減少選擇性堿基的錯(cuò)配,為選擇性擴(kuò)增提供更多的模板,同時(shí)對(duì)模板起到選擇性純化的作用,避免直接擴(kuò)增造成的指紋帶型背景拖尾現(xiàn)象,從而使產(chǎn)生的指紋圖譜更清晰和具有更好的重復(fù)性。DNA擴(kuò)增反應(yīng)再次擴(kuò)增以預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，采用含