aflp分子標(biāo)記及其在植物遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用

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1、AFLP分子標(biāo)記及其在植物遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用　　本文簡述了AFLP(AmplifiedFragmentLengthPolymoplvism)分子標(biāo)記技術(shù)的原理和技術(shù)流程，并對其在植物遺傳作圖與基因定位、種質(zhì)資源鑒定、植物分類、進(jìn)化及遺傳多樣性等方面的應(yīng)用作了概述遺傳標(biāo)記是指可以明確反映遺傳多態(tài)性的生物特征。在經(jīng)典遺傳學(xué)中，遺傳多態(tài)性是指等位基因的變異。在現(xiàn)代遺傳學(xué)中，遺傳多態(tài)性是指基因組中任何座位上的相對差異。遺傳標(biāo)記可以幫助人們更好地研究生物的遺傳與變異規(guī)律。在遺傳學(xué)研究中遺傳標(biāo)記主要應(yīng)用于連鎖分析、基因定位、遺傳作圖及基因轉(zhuǎn)移等隨著分子

2、遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展和PCR技術(shù)的出現(xiàn)，人們將目光投向直接基于DNA和PCR技術(shù)的分子標(biāo)記技術(shù)，如基于DNA分子雜交的RFLP和基于PCR反應(yīng)的RAPD、AFLP、SSR等分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物基因組研究[1，2]AFLP(AmplifiedFragmentLengthPolymoplvism)分析技術(shù)是由Zabeau等于1992年發(fā)明并由Vos等發(fā)展起來的一種檢測DNA多態(tài)性的新方法[3，4]。由于結(jié)合了RFLP和RAPD的技術(shù)優(yōu)勢，AFLP兼具了穩(wěn)定性強(qiáng)和靈敏度高的特點(diǎn)，同時(shí)也因?yàn)樗S富的多態(tài)信息量（polymorphism9info

3、rmationcontents,PIC）和易操作性而被廣泛用于DNA指紋分析、遺傳圖譜構(gòu)建、基因鑒定和克隆、基因表達(dá)、遺傳多樣性等方面，是近幾年發(fā)展最快的DNA分子標(biāo)記技術(shù)。下面對AFLP技術(shù)的原理、操作及其在植物遺傳、進(jìn)化等領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行簡要介紹1AFLP標(biāo)記的基本原理9AFLP的基本原理(見圖1所示)是基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶完全消化后，在限制性片段兩端連接上人工接頭作為擴(kuò)增的模板。實(shí)際的引物與接頭和酶切位點(diǎn)互補(bǔ)，并在3’加上2～3個(gè)選擇性堿基，因此在基因組被酶切后的無數(shù)片段中，只有一小部分限制性片段被擴(kuò)增，即只有那些與引物3’端互補(bǔ)

4、的片段才能進(jìn)行擴(kuò)增，稱為選擇性擴(kuò)增。為了對擴(kuò)增片段的大小進(jìn)行靈活的調(diào)節(jié)，一般采用兩個(gè)限制性內(nèi)切酶。一個(gè)是切點(diǎn)多的酶，如具有4堿基識別位點(diǎn)的MseI，它產(chǎn)生較小的DNA片段，另一個(gè)是切點(diǎn)少的酶，如具有6堿基識別位點(diǎn)的EcoRI，它產(chǎn)生較大的DNA片段。上述兩種酶產(chǎn)生三種酶切片段，理論上90%以上為MseI-MseI片段，只有一小部分為EcoRI-EcoRI片段，EcoRI-Msel片段為EcoRI酶切位點(diǎn)的兩倍左右，擴(kuò)增的片段主要是兩個(gè)酶的組合產(chǎn)生的酶切片段。Vos等[3]指出，多切點(diǎn)的酶產(chǎn)生小的DNA片段，這些片段能很好地?cái)U(kuò)增，適于在變性序

5、列膠上分離，少切點(diǎn)的酸可以減少被擴(kuò)增的片段，只有兩種酶組合后產(chǎn)生的片段即E-M才是主要擴(kuò)增的片段，故采用雙酶切可以極其靈活控制被擴(kuò)增片段的大小和數(shù)目。再者在合成引物時(shí)只需用同位素或熒光標(biāo)記EcoRI引物或MseI引物，故采用雙酶切有可能對雙鏈PCR產(chǎn)物進(jìn)行單鏈標(biāo)記，從而避免了由于雙鏈擴(kuò)增片段在變性電泳膠上不均等遷移而造成的誤差，并通過少數(shù)引物的多種組合可產(chǎn)生極其大量的DNA指紋2AFLP的技術(shù)流程AFLP技術(shù)流程主要包括三個(gè)步驟：①經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶解后的DNA限制性片段，與雙鏈多聚核苷酸接頭（adapter）連接；②利用PCR方法，通過變性

6、、退火、延伸循環(huán)，選擇性擴(kuò)增成套的限制性片段，經(jīng)過多次循環(huán)，可使目的序列擴(kuò)增到0.5～1ug；③延用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離檢測擴(kuò)增的DNA片段2.1DNA限制性片段的獲得及其與接頭的連接基因組DNA通過限制性內(nèi)切酶酶解產(chǎn)生限制性片段。一般使用兩種限制性內(nèi)切酶。酶切完成后在T4連接酶作用下與接頭進(jìn)行連接反應(yīng)Fig1theprincipleofAmplifiedFragmentLengthPolymorphism2.2限制性片段的選擇性擴(kuò)增9AFLP反應(yīng)一般使用兩種引物，擴(kuò)增條件根據(jù)AFLP引物的選擇性堿基性質(zhì)而定。對于較復(fù)雜基因組的AFLP分

7、析一般兩步擴(kuò)增策略，即先用無或單選擇堿基引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增。一般來講，預(yù)擴(kuò)增引物選擇堿基數(shù)為1個(gè)，選擇性擴(kuò)增引物的選擇堿基數(shù)為3個(gè)。預(yù)擴(kuò)增能夠?yàn)檎綌U(kuò)增提供足夠的模板，而且其中的兩個(gè)引物無需同位素標(biāo)記。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物用TE（pH8.0）緩沖液稀釋10倍后用于第二步的選擇性擴(kuò)增反應(yīng)。其中引物的選擇性堿基為2-3個(gè)，可根據(jù)基因組大小和實(shí)際擴(kuò)增情況來確定引物末端所需的選擇性核苷酸數(shù)目。經(jīng)驗(yàn)指出，一般大于108bp的基因組DNA可用兩個(gè)末端各有3個(gè)選擇性堿基的引物進(jìn)行擴(kuò)增，而105-108bp基因組DNA可用兩個(gè)分別含有2個(gè)或3個(gè)選擇性堿基的引物進(jìn)行擴(kuò)增。

8、值得注意的是，當(dāng)使用放射性同位素或熒光標(biāo)記引物時(shí)，通常只對其中一條引物進(jìn)行標(biāo)記，一般優(yōu)先考慮EcoRⅠ引物2.3擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳分析9擴(kuò)增產(chǎn)物的分離通常在4%-6%的變性聚丙烯酰