AFLP 分子標記及其在茶樹遺傳育種中的應用

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1、AFLP分子標記及其在茶樹遺傳育種中的應用研究生5班食品科學劉艷二、四、三、AFLP技術的原理和操作過程AFLP在茶樹遺傳育種上的應用AFLP在茶樹育種上的應用前景一、AFLP分子標記技術的背景介紹AFLP背景介紹出現(xiàn)：AFLP(amplifiedfragmentlengthpolymorphism,AFLP)擴增片段長度多態(tài)性是一種選擇性擴增限制性片段的方法,是一種實用的,有效的新的一種DNA分子標記技術,是由荷蘭Keygene公司科學家Zabeau和Vos發(fā)展起來的一種檢測DNA多態(tài)性的方法,1993年獲得歐洲專利局專利。該技術是繼RFLP、SSR和RAPD之后發(fā)

2、展起來的DNA指紋技術。用途：由于AFLP擴增可使某一品種出現(xiàn)特定的DNA譜帶，而在另一品種中可能無此譜帶產(chǎn)生，因此，這種通過引物誘導及DNA擴增后得到的DNA多態(tài)性可做為一種分子標記。已廣泛用于基因鑒定、基因作圖、基因表達等方面,在茶樹遺傳育種研究領域也正在逐步拓展,具有較大的應用潛力。被認為是迄今為止最理想的一種DNA分子標記技術之一.AFLP背景介紹RFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性）是第一代分子生物學標記，主要包括以下基本步驟：DNA提取→用限制性內(nèi)切酶酶切DNA→用凝膠電泳分開DN

3、A片段→把DNA片段轉移到濾膜上→利用放射性標記的探針雜交顯示特定的DNA片段（Southern雜交）和結果分析。RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA）即隨機擴增多態(tài)性DNA標記，RAPD是建立在PCR基礎之上的一種可對整個未知序列的基因組進行多態(tài)性分析的分子技術，其基本原理與PCR技術一致。其以基因組DNA為模板，以單個人工合成的隨機多態(tài)核苷酸序列(通常為10個堿基對)為引物，在熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(Taq酶)作用下，進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖或聚丙烯酰胺電泳分離、溴化乙錠染色后，在紫外透視儀上檢測多態(tài)性。擴增產(chǎn)物的多態(tài)性反映了

4、基因組的多態(tài)性。AFLP背景介紹AFLP優(yōu)點：DNA用量少、靈敏度高,不需要預先知道基因組的信息。一般一次反應可得到50～150個擴增片段,具有很高的可靠性,被認為是效率最高的標記。AFLP采用長引物和更高的退火溫度進行PCR,比RAPD等其他以PCR為基礎的分子標記具有更好的重復性。這種方法由于結合了RFLP和PCR的優(yōu)點,既具有RFLP可靠性好、重復性高的特點,同時又具有PCR的高效性、安全性和方便性的優(yōu)點。AFLP標記所檢測的多態(tài)性本質上與RFLP一致,但技術上卻簡單的多,并且可以通過控制引物隨機核苷酸的種類和數(shù)目來調節(jié)AFLP產(chǎn)物的條帶的特異性和數(shù)量,因此能提

5、供較多的基因組多態(tài)性信息。AFLP基本原理AFLP是通過PCR反應先把酶切片段擴增:實驗中酶切片段首先與含有與其共同粘性末端的人工接頭連接,連接后的粘末端順序和接頭順序就作為以后PCR反應的引物結合位點。根據(jù)具體需要通過選擇在末端上分別添加了1-3個選擇性核苷酸的不同引物,這些選擇性核苷酸使引物能選擇性地識別具有特異配對順序的內(nèi)切酶片段并與之結合,實現(xiàn)選擇性擴增。然后把擴增的酶切片段在高分辨率的順序分析膠上進行電泳,多態(tài)性即以擴增片段的長度不同被檢測出來。AFLP技術流程圖AFLP技術流程1、模板DNA的制備2、DNA擴增反應3、擴增產(chǎn)物的分離與檢測模板DNA的制備檢

6、測制備好待測DNA樣品經(jīng)過濃度和質量,用具有6個堿基識別位點通常是EcoRI(G/AATTC)和4個堿基識別位點的MseI(T/TAA)兩種內(nèi)切酶進行酶切,形成三種類型的酶切片段。DNA酶切完成后,經(jīng)加熱讓限制性內(nèi)切酶失活,酶切片段在T4連接酶的作用下與兩種內(nèi)切酶相應的特定接頭相連接,形成帶接頭的特異性片段，作為擴增反應的模板。模板DNA的制備用于限制性片段切割的二種酶，一種是罕見切割酶，一種是常用切割酶。AFLP的接頭是一種人工合成的雙鏈DNA,長度一般為14～18個核苷酸,由核心序列和內(nèi)切酶位點特異序列兩部分組成。由于EcoRI酶切可以產(chǎn)生小片段DNA便于擴增,M

7、seⅠ酶切可以產(chǎn)生小而穩(wěn)定的酶切片段,因此,目前EcoRI接頭和MseⅠ接頭已廣泛應用于AFLP多態(tài)性分析中。DNA擴增反應以酶切后連接產(chǎn)物作為模板,用人工合成的選擇性單鏈寡核苷酸作為引物，在Taq聚合酶的作用下，完成AFLP的選擇性擴增。酶切片段要經(jīng)過連續(xù)兩次PCR擴增。預擴增采用含有一個選擇性堿基或不含選擇性堿基的引物進行。目的：為了減少選擇性堿基的錯配,為選擇性擴增提供更多的模板,同時對模板起到選擇性純化的作用,避免直接擴增造成的指紋帶型背景拖尾現(xiàn)象,從而使產(chǎn)生的指紋圖譜更清晰和具有更好的重復性。DNA擴增反應再次擴增以預擴增產(chǎn)物為模板，采用含