珍稀瀕危樹種毛紅椿微衛(wèi)星dna分離及ssr反應(yīng)體系優(yōu)化

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1、中國生物工程雜志ChinaBiotechnology,2006,26(12):50~55珍稀瀕危樹種毛紅椿微衛(wèi)星DNA分離及*SSR反應(yīng)體系優(yōu)化121**11劉軍孫宗修陳益泰何貴平吳天林(1中國林業(yè)科學(xué)院亞熱帶林業(yè)研究所富陽3114002中國水稻研究所水稻生物學(xué)國家重點實驗室杭州310006)摘要以江西宜豐種源毛紅椿為材料,成功提取其基因組DNA。利用改良的鏈親和素磁珠法親和捕捉出毛紅椿基因組微衛(wèi)星DNA片段,并構(gòu)建了富含微衛(wèi)星的基因組文庫。從構(gòu)建的基因組文庫中隨機挑選了63個單克隆進行測序,其中50個單克隆成功測序,含有微衛(wèi)星的單克隆有18個,并根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計并合成SSR引物18對。利

2、用所合成的引物優(yōu)化SSR反應(yīng)體系,對影響SSR反應(yīng)的各個因子進行了探討。確定了模板DNA最適濃度為30ng;dNTP的最適濃度為0.3mmol/L;0.3Lmol/L是引物在反應(yīng)體系中的最合適濃度。建立了重復(fù)性好、穩(wěn)定性好的SSR反應(yīng)體系,為下一步進行毛紅椿群體遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳變異研究提供了技術(shù)支持。關(guān)鍵詞毛紅椿微衛(wèi)星鏈親和素磁珠SSR反應(yīng)體系中圖分類號Q819毛紅椿[Toonaciliatavar.pubescens(Franch.)等優(yōu)點,是構(gòu)建遺傳連鎖圖譜、研究群體遺傳學(xué)、進行[5,6]Hand.]是楝科香椿屬植物,零星分布于江西、湖南、湖分子標(biāo)記輔助育種和系譜分析的理想工具。微衛(wèi)[1

3、]北、四川、廣東、貴州和云南等地。毛紅椿為落葉大喬星最大的缺點是對首次研究的物種要從中分離微衛(wèi)星木,生長迅速,樹干通直,素有/中國桃花木0之稱,材質(zhì)曙DNA,這主要是因為微衛(wèi)星通常存在于基因組的非編紅,木紋美麗,是珍貴的用材樹種,具有很高的經(jīng)濟價值碼區(qū)。傳統(tǒng)的微衛(wèi)星DNA分離方法是先建立基因組和開發(fā)前景。由于環(huán)境變化、人為砍伐以及其天然更新文庫,再用含微衛(wèi)星的探針與之雜交篩選文庫,可以說比較慢,數(shù)量不斷減少。在《中國植物紅皮書》中,毛紅椿是一種費時費力的工作。應(yīng)用這種傳統(tǒng)方法分離微衛(wèi)被列為國家二級保護瀕危種,毛紅椿也被各分布省列為星DNA所得到的陽性克隆(含微衛(wèi)星DNA)的數(shù)量只[2,3]

4、珍惜瀕危樹種。目前毛紅椿人工林的用種主要采自[4]有全部克隆的0.04%~12%。近幾年來,一些新的數(shù)量較少的天然林和人工林,所以進行系統(tǒng)的良種選育微衛(wèi)星DNA分離方法相繼出現(xiàn),解決了傳統(tǒng)方法所遇和分子生物學(xué)研究,擴大毛紅椿的種植面積并研究其瀕[7]到的困難,提高了微衛(wèi)星分離效率。本研究主要目危原因,進而采取積極有效的保護措施是非常必要的。的:(1)用改良的鏈親和素磁珠法首次分離毛紅椿基因微衛(wèi)星DNA又稱簡單重復(fù)序列(singlesequence組微衛(wèi)星DNA并測序;(2)根據(jù)所分離的微衛(wèi)星DNArepea,tSSR),是由1~6個核苷酸組成的重復(fù)單元以首序列設(shè)計、合成SSR引物;(3)利

5、用所合成的引物優(yōu)化尾相接的方式重復(fù)出現(xiàn)多次而形成的一段DNA序列,SSR反應(yīng)體系,建立重復(fù)性好、穩(wěn)定性好的SSR反應(yīng)體[4]廣泛分布于所有原核生物和真核生物基因組中。系,為下一步進行毛紅椿群體遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳變異研SSR標(biāo)記是一種基于DNA長度多態(tài)性的分子標(biāo)記技究提供了技術(shù)支持。術(shù),它具有共顯性、高度可重復(fù)性、高度豐富的多態(tài)性1材料與方法收稿日期:2006-07-28修回日期:2006-10-241.1材料*浙江省科技重點項目(011102198)**通訊作者,電子信箱:ytc.yalin@yahoo.com.cn1.1.1植物材料2004年11月采集江西宜豐種源天2006,26(12)劉軍

6、等:珍稀瀕危樹種毛紅椿微衛(wèi)星DNA分離及SSR反應(yīng)體系優(yōu)化51然林種子,2005年3月,在浙江省富陽市新登苗圃接,連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5A,涂到含氨芐霉(N30b03cE119b57c)播種。7月份采集毛紅椿幼苗幼素的LB培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。37e過夜培養(yǎng),挑取單克嫩葉片用塑料袋密封,用冰袋保鮮,迅速帶回實驗室隆接種到含氨芐霉素的LB液體培養(yǎng)基中,180r/min搖后,保存到-70e低溫冰箱。10h,取0.5ml菌液送公司(聯(lián)合基因)測序。(6)SSR1.1.2微衛(wèi)星分離材料鏈親和素磁珠(Promega)一引物設(shè)計與合成根據(jù)測序結(jié)果,利用prmierprmiier5管(約600Ll)

7、;磁力架(Promega)一個;生物素標(biāo)記探針軟件設(shè)計引物,設(shè)計結(jié)果送交公司(Sangon)合成。(Sangon):5c-生物素(AG)10;接頭Ⅰ序列為OligoA:5c-1.2.2SSR反應(yīng)體系的優(yōu)化SSR反應(yīng)體系的建立以[8]ATGACCATGATTACGCCAG-3,OligoB:5c-GATCCTGG楓香PCR擴增程序為基礎(chǔ),以江西宜豐種源毛紅椿CGTACTCATGGTCAT3c;接頭Ⅱ序列為OligoC:5c