葉綠素的提取與含量測定

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1、實(shí)驗(yàn)報(bào)告課程名稱：植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)老師：成績：__________________實(shí)驗(yàn)名稱：葉綠體色素的提取、分離、理化性質(zhì)和葉綠素含量的測定實(shí)驗(yàn)類型：同組學(xué)生姓名：一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅ū靥睿┒?、?shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理（必填）三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑（必填）四、實(shí)驗(yàn)器材與儀器（必填）五、操作方法和實(shí)驗(yàn)步驟（必填）六、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和處理七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析（必填）八、討論、心得一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅?．掌握植物中葉綠體色素的提取分離和性質(zhì)鑒定。2．掌握定量分析的原理和方法。裝訂二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理：以青菜為材料，提取和分離葉綠體色素并進(jìn)行理化性質(zhì)測定和葉綠素含量分析。原理如下：1．葉綠素和類胡蘿卜素均不溶于水而

2、溶于有機(jī)溶劑，常用95%的乙醇或80%的丙酮提取。線2．皂化反應(yīng)。葉綠素是二羧酸酯，與強(qiáng)堿反應(yīng)，形成綠色的可溶性葉綠素鹽，就可與有機(jī)溶劑中的類胡蘿卜素分開。3．取代反應(yīng)。在酸性或加溫條件下，葉綠素卟啉環(huán)中的Mg2+,可依次被H+和Cu2+取代形成褐色的去鎂葉綠素和綠色的銅代葉綠素。4．葉綠素受光激發(fā)，可發(fā)出紅色熒光，反射光下可見紅色熒光。5．定量分析。葉綠素吸收紅光和藍(lán)紫光，紅光區(qū)可用于定量分析，其中a,b及總量，而652可直接用于總量分析。645和663用于定量葉綠素三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑材料：青菜葉試劑：KOH固體、醋酸銅粉末、醋酸四、主要儀器設(shè)備：1．天平（萬分之一）、可掃描分光光度計(jì)、

3、離心機(jī)2．研具、PE管、酒精燈等五、操作方法和實(shí)驗(yàn)步驟（必填）1．定性分析：熒光現(xiàn)象：鮮葉3-5g+95%乙醇15ml（逐步加入）,磨成勻漿，過濾入三角瓶，觀察熒光現(xiàn)象皂化反應(yīng)：加KOH數(shù)片劇烈搖均，加石油醚1ml和H2O1ml，分層后觀察取代反應(yīng)：加醋酸約1ml，觀察顏色，取1/2加醋酸銅粉，加熱變亮綠色2．葉綠素和類胡蘿卜素的吸收光譜測定：皂化反應(yīng)的上層黃色石油醚溶液（稀釋470nmOD0.5-1），在400-700nm處掃描光譜，分別測定類胡蘿卜素的吸收峰反復(fù)用石油醚粹取,直到無類胡蘿卜素,離心得葉綠素(鹽)，（稀釋663nmOD0.5-1），分別測定葉綠素的吸收峰3．葉綠素定量分析：鮮

4、葉0.1g，加1.9mlH2O，磨成勻漿，取清液在645，652，663測定OD，計(jì)算2份0.2mlChla,Chlb和加80%丙酮4.8ml,Chl總量的值。搖勻，4000轉(zhuǎn)離心3min,上六、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和處理1．熒光現(xiàn)象：透射光綠色，反射光紅光2．皂化反應(yīng)：上層呈黃色，為類胡蘿卜素，吸收藍(lán)紫光。下層呈綠色。為葉綠素。吸收藍(lán)紫光和紅光。皂化反應(yīng)分層3.類胡蘿卜素和葉綠素的吸收光譜測定：上層黃色溶液掃描光譜吸收峰為468nm、439nm、413nm、667nm和606nm五個(gè)下層綠色溶液掃描光譜吸收峰為414nm、526nm、639nm三個(gè)4．取代反應(yīng)：加醋酸約1ml，變褐（取1/

5、2加醋酸銅粉加熱變去鎂葉綠素）亮綠色，為銅代葉綠素。去鎂葉綠素銅代葉綠素5.葉綠素含量測定波長/nm吸光度（第一組）吸光度（第二組）6450.0680.0726520.0930.0956630.1640.170根據(jù)公式：Ca(mg/L)=12.7OD663-2.69OD645Cb(mg/L)=22.9OD645-4.68OD663C=OD1000/34.5T(mg/L)652Chla含量(mg/g.FW)=（Ca(mg/L)/1000）2/0.15/0.2Chlb含量(mg/g.FW)=（Cb(mg/L)/1000）2/0.15/0.2Chl總含量(mg/g.FW)=（C/1000）2/0.

6、15/0.2T(mg/L)求得：C=1.899mg/LCa2=1.965mg/La1Cb1=0.790mg/LCb2=0.853mg/LCT1=2.696mg/LCT2=2.754mg/LChla含量1=0.950mg/g.FWChla含量1=0.982mg/g.FWChlb含量1=0.395mg/g.FWChlb含量1=0.426mg/g.FWChl總含量1=1.348mg/g.FWChl總含量1=1.377mg/g.FW七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析類胡蘿卜素和葉綠素的吸收光譜測定：類胡蘿卜素的吸收峰為藍(lán)紫光區(qū)468nm、439nm、413nm三個(gè)峰，在紅光區(qū)667nm和606nm的峰說明葉綠素有殘留

7、。葉綠素在藍(lán)紫光區(qū)有414nm、526nm兩個(gè)峰，在紅光區(qū)有639nm一個(gè)峰，藍(lán)紫光區(qū)的峰比紅光區(qū)的高，說明葉綠素吸收藍(lán)紫光的能力比紅光強(qiáng)。葉綠素含量測定：Chla含量1=0.950mg/g.FWChla含量1=0.982mg/g.FWChlb含量1=0.395mg/g.FWChlb含量1=0.426mg/g.FWChl總含量1=1.348mg/g.FWChl總含量1=1.377mg/g.FW兩組