葉綠素的提取與分析測(cè)定

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1、植物葉綠體色素的分析一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、學(xué)會(huì)葉綠體色素的分離方法。2、掌握葉綠素的定量測(cè)定。一、3、了解高等植物葉綠體色素的種類組成、性質(zhì)。二、實(shí)驗(yàn)原理：1、葉綠體色素的提?。海?）原理：葉綠體色素是植物捕獲太陽(yáng)能進(jìn)行光合作用的重要物質(zhì)，高等植物的葉綠體色素一般由葉綠素a、葉綠素b、胡蘿卜素和葉黃素等組成。葉綠體色素的提取是利用葉綠體色素能溶于有機(jī)溶劑的特性,將待測(cè)的植物葉片用研缽研磨讓植物組織破碎，利用丙酮的溶解能力將葉綠體色素溶于丙酮中，通過(guò)用濾紙過(guò)濾分離植物組織碎片，即可以得到葉綠體色素的丙酮粗提液。（2）步驟：稱取

2、新鮮的植物葉子(菠菜等)4g，放入研體中加5ml80%丙酮，少許碳酸鈣和石英砂,研磨成勻漿,再加入20ml丙酮，以漏斗過(guò)濾到棕色瓶中備用2、葉綠體色素的分離：（1）原理：葉綠體色素的分離提純一般用層析的方法，其中紙層析是最簡(jiǎn)單的一種。當(dāng)溶劑不斷地從紙上流過(guò)時(shí)，由于混合物中各成分在流動(dòng)相和固定相間具有不同的分配系數(shù)，引起它們的移動(dòng)速度不同，因而使混合物分離。（2）步驟：1）取濾紙條(6.5×30cm),在離紙邊1.5cm處用鉛筆劃一直線，在另一端兩角分別拴上一根線(見圖1)，用毛細(xì)管取吸綠素提取液沿著鉛筆線劃一條樣帶，使樣

3、帶寬度在3mm以內(nèi)，如色素過(guò)淡用電吹風(fēng)吹干后再點(diǎn)數(shù)次，直到樣帶呈深綠色為止。2）在層析缸中加入四氯化碳20ml及少許無(wú)水硫酸鈉,然后將濾紙吊在層析缸中,使下端浸入溶劑中,色素點(diǎn)要略高于液面,濾紙條邊緣不可碰到層析缸璧(如圖2)用聚乙烯薄膜兩層封住層析缸,直立于暗處層析。3）0.5小時(shí)后，觀察色素帶分布(最上端是橙黃色的胡蘿卡素，其次是黃色的葉黃素，然后是蘭綠色的葉綠素a和黃綠色的葉綠素b)，記錄色譜圖。如圖所示：3、葉綠體色素的性質(zhì)（一）熒光現(xiàn)象：葉綠體色素在吸收光能以后可以從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)處于第一單線態(tài)（激發(fā)態(tài)）

4、的電子再回到基態(tài)時(shí)其攜帶的能量將以光的形式放射出來(lái)產(chǎn)生熒光，葉綠素?zé)晒獾念伾羌t色的。由于熒光的光強(qiáng)度很弱只能在反射光的方向可以看到。如果我們將提取液放入試管中，觀察反射光和透射光的顏色，反射光的顏色即為葉綠素產(chǎn)生熒光的顏色為血紅色。【如右圖：】（二）氫代葉綠素&銅代葉綠素：C55H72O5N4Mg+H+===C55H74O5N4+Mg++H+C55H72O5N4Mg+Cu++===C55H72O5N4Cu+Mg++葉綠素取上述提取液少許于試管中，加入2滴濃鹽酸，溶液呈現(xiàn)褐綠色，此時(shí)葉綠素變?yōu)槿ユV葉綠素。在褐綠色溶液中加

5、入醋酸銅結(jié)晶少許，漸漸加熱直至鮮綠色產(chǎn)生，這時(shí)銅已在葉綠素分子中代替了Mg的位置。?（三）皂化作用：葉綠素是含有兩個(gè)酸根的酯，加堿可發(fā)生皂化反應(yīng)，得到葉綠酸的鹽、甲醇和葉綠醇，葉綠酸鹽可溶于水。取3ml色素提取液，加lm120%KOH甲醇溶液,小心加熱到沸騰,冷卻后,加入2ml苯,混勻，加入3m1水靜止后得到兩層溶液,上層是苯的胡蘿卜素和葉黃素溶液，下層是葉綠酸a和葉綠酸b的鉀鹽溶液。另外在3ml上述色素提取液中直接加2ml苯，混勻，加入3ml水，對(duì)比皂化和沒(méi)皂化溶液有何不同。照相記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（左圖為皂化溶液，右圖沒(méi)皂

6、化）4、葉綠體色素的定量分析：葉綠體色素能夠吸收一定波長(zhǎng)的光，而讓其他波長(zhǎng)的光透過(guò)，這是葉綠體色素的光學(xué)特征之一,將色素的吸光度對(duì)波長(zhǎng)作圖，所繪制的曲線稱為吸收光譜曲線。葉綠素在80%的丙酮溶液中，在長(zhǎng)波方面的最大吸收峰分別位于663nm和645nm,同時(shí)該波長(zhǎng)葉綠素的比吸收系數(shù)k為已知,根據(jù)Lambert-Beer定律,溶液中葉綠素濃度C與溶液的吸光度A之間的關(guān)系式為：A663=82.04Ca十9.27Cb(1)A645=16.75Ca＋45.6Cb(2)解方程(1)(2),則得:CA(mg/L)=12.7A663-2

7、.69A645CB(mg/L)=22.9A645-4.68A663CT(mg/L)=CA+CB=20.2A645+8.02A633計(jì)算葉綠素提取液的濃度，并根據(jù)提取液的體積植物組織的鮮重，算出樣品中葉綠素a和葉綠素b的含量mg/g。樣品中葉綠素a含量（mg/g）=提取液葉綠素a濃度（mg/L)*提取液體積（L）/葉片重量（g）樣品中葉綠素b含量（mg/g）=提取液葉綠素b濃度（mg/L)*提取液體積（L）/葉片重量（g）5、葉綠體色素的吸收光譜：葉綠體色素對(duì)可見光有吸收，測(cè)定葉綠素提取液對(duì)400～700nm波長(zhǎng)的吸收，了

8、解葉綠素提取液對(duì)400～700nm的可見光的吸光度同光的波長(zhǎng)之間的關(guān)系。要求分別測(cè)定葉綠體色素、分離后的葉綠素a和葉綠素b的吸收光譜。三、實(shí)驗(yàn)材料：菠菜(Spinaciaoleracea)四、實(shí)驗(yàn)步驟：1.定性色素提取2.定量色素提取3.層析4.熒光現(xiàn)象5.氫、銅在葉綠素分子中的代替作用6.皂化反應(yīng)7.定量測(cè)定8.吸