巴馬小型豬精原干細(xì)胞相關(guān)問題的研究.pdf

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1、萬方數(shù)據(jù)巴馬小型豬精原干細(xì)胞相關(guān)問題的研究趙會(huì)敏袁西夫嘗二0一四年五月萬方數(shù)據(jù)分類號(hào)S晝2墨：窆±窆UDC博士學(xué)位論文密級(jí)巴馬小型豬精原干細(xì)胞相關(guān)問題的研究學(xué)科專業(yè)指導(dǎo)老師趙會(huì)敏論文答辯日期2Q曼壘生Q§目2墨目學(xué)位授予日期——答辯委員會(huì)主席值筮萬方數(shù)據(jù)廣西大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性和使用授權(quán)聲明本人聲明所呈交的論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下獨(dú)立進(jìn)行研究所取得的研究成果。除已特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫的研究成果，也不包含本人或他人為獲得廣西大學(xué)或其它單位的學(xué)位而使用過的材料。與我一同工作

2、的同事對(duì)本論文的研究工作所做的貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確說明。本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下所完成的學(xué)位論文及相關(guān)的職務(wù)作品，知識(shí)產(chǎn)權(quán)歸屬廣西大學(xué)。本人授權(quán)廣西大學(xué)擁有學(xué)位論文的部分使用權(quán)，即：學(xué)校有權(quán)保存并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交學(xué)位論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱，可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索和傳播，可以采用影印、縮印或其它復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。本學(xué)位論文屬于：口保密，在年解密后適用授權(quán)。／形F保密。(請(qǐng)?jiān)谝陨舷鄳?yīng)方框內(nèi)打“√”)論文作者簽名—羞舷艚教師簽名鄉(xiāng)≥車～作者聯(lián)系電話：房?7留P多

3、紅妙日期：2．o／q'．‘．2J"日期：如／午．f．厲電子郵箱：多kJ

4、I“M溯一l一痧眨f·co朋萬方數(shù)據(jù)巴馬小型豬精原干細(xì)胞相關(guān)問題的研究摘要精原干細(xì)胞(spermatogonialstemcells，SSCs)位于動(dòng)物睪丸的精細(xì)小管，是動(dòng)物體內(nèi)唯一一種定向分化為精子的成體干細(xì)胞。分離、純化和體外培養(yǎng)SSC，可以為SSC的體外研究提供必要的實(shí)驗(yàn)材料。定向誘導(dǎo)SSC分化成精子可以研究精子發(fā)生的機(jī)理，同時(shí)也可以為無精癥患者提供生育自己后代的機(jī)會(huì)。通過轉(zhuǎn)染SSC，誘導(dǎo)其分化成攜帶有外源基因的精子細(xì)胞或精子，利用這些攜帶外

5、源基因的精子細(xì)胞或精子受精就可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。這種轉(zhuǎn)基因胚胎產(chǎn)生的過程和自然條件下精子、卵子結(jié)合產(chǎn)生胚胎的過程一樣，不涉及體細(xì)胞重編程過程，所以利用SSC生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的效率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于體細(xì)胞核移植法。本論文的研究內(nèi)容是巴馬小型豬SSC的分離、純化、鑒定、體外長期培養(yǎng)以及轉(zhuǎn)基因的研究，其結(jié)果如下：1．巴馬小型豬睪丸的形態(tài)學(xué)觀察和精原干細(xì)胞的鑒定本研究首先對(duì)巴馬小型豬睪丸組織進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察和SSC的鑒定。組織學(xué)觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)1月齡仔豬睪丸的SSC還沒有分化，而2月齡仔豬睪丸中已經(jīng)有精子產(chǎn)生，所以1月齡仔豬睪丸適合于SSC

6、的分離。已有的研究證明豬的精原干細(xì)胞表達(dá)UCHLl，并且可以和植物凝集素DBA結(jié)合，SSC的免疫組織化學(xué)鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)巴馬小型豬SSC表達(dá)UCHLl和CDHl，可以和植物凝集素DBA結(jié)合，但不表達(dá)C-KIT，從而證明抗體UCHLI、CDHI以及植物凝集素DBA是巴馬小型豬SSC的生物標(biāo)志物，可以用來鑒定體外培養(yǎng)的SSC。所以，本研究選用抗體UCHLI、CDHI和植物凝集素DBA用來鑒定體外培養(yǎng)的精原干細(xì)胞。2．精原干細(xì)胞的分離和體外培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)采用組合酶消化法將巴馬小型豬睪丸組織消化成分散的細(xì)胞，培養(yǎng)60h，擴(kuò)增SSC的數(shù)

7、量，然后通過差異貼壁法分選出SSC，將分離出的細(xì)胞接種到STO飼養(yǎng)層上進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)的前兩代，由于細(xì)胞的數(shù)量少，不能形成細(xì)胞簇，從第三代開始，很多細(xì)胞聚集在一起形成細(xì)胞簇，這些細(xì)胞簇的細(xì)胞結(jié)合不夠緊密，邊緣不清晰。目前為止，SSC在體外已經(jīng)傳代達(dá)30代，維持了細(xì)胞簇形成的特性。萬方數(shù)據(jù)3．體外培養(yǎng)的精原干細(xì)胞的鑒定免疫熒光染色結(jié)果顯示這些細(xì)胞簇表達(dá)SSC生物標(biāo)志物UCHLl和CDttl，并且可以和植物凝集素DBA結(jié)合，細(xì)胞簇中部分細(xì)胞表達(dá)OCT4；RT—PCR檢測結(jié)果證明這些細(xì)胞簇表達(dá)基因nanog、sox2、陽sa

8、、uchll和thyl，鑒定結(jié)果證明這些細(xì)胞簇是由SSC組成。在體外培養(yǎng)的SSC中存在著大小不同的UCHLl陽性細(xì)胞，說明SSC大小本身存在著差異。SSC超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的SSC的線粒體脊比組織內(nèi)SSC線粒體脊豐富。DNA含量分析顯示部分巴馬小型豬SSC在體外長期培養(yǎng)后經(jīng)流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)單倍體峰。4．精原干細(xì)胞轉(zhuǎn)基因方法的初步探索本研究嘗試將外源基因?qū)氲絊SC中。首先嘗試?yán)弥|(zhì)體轉(zhuǎn)染法將攜帶有綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到SSC中，但結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種轉(zhuǎn)染途徑效率低，不能得到陽性細(xì)胞簇。之后，我們嘗試?yán)寐《靖?/p>

9、染法將外源基因?qū)氲絊SC內(nèi)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在MOI(multiplicityofinfection)值為50時(shí)，可以有效的將GFP基因?qū)氲絊SC內(nèi)，可以得到陽性細(xì)胞簇。綜上所述，本研究分離純化了巴馬小型豬SSC，這些SSC可在體外培養(yǎng)到30代以上，為精原干細(xì)胞的基因操作和精子分化機(jī)理的研究提供了充足的實(shí)驗(yàn)材料。本研究還發(fā)現(xiàn)巴馬小型豬