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《超順磁性氧化鐵標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療兔急性胰腺炎的磁共振活體示蹤-論文.pdf》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、November2013,Vo1.13,No.1l·1419·中國藥物與臨床2013年11月第l3卷第11期ChineseRemedies&Clinics,——·基礎(chǔ)研究·超順磁性氧化鐵標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療兔急性胰腺炎的磁共振活體示蹤張瑞平姜增譽李健丁重癥急性胰腺炎(severeacutepancreatitis,SAP)是由各間層MSCs,加入到含5ml培養(yǎng)基的無菌離心管中。常溫下種原因引起胰酶被激活,導(dǎo)致胰腺組織自身消化、水腫、出血以1000r/min離心洗滌l0min,棄去上清,取細胞沉淀。細胞和壞死的炎癥反應(yīng),常繼發(fā)感染性腹膜炎、休克、
2、全身炎癥反沉淀中加入含20%胎牛血清的L.DMEM培養(yǎng)基,調(diào)整細胞密應(yīng)綜合征和多器官功能障礙綜合征等嚴重并發(fā)癥,預(yù)后極度約1~106/ml,接種于25cm細胞培養(yǎng)瓶,在37℃,體積分差[1]。目前的治療措施主要是對癥治療、支持治療、預(yù)防胰腺數(shù)為5%CO:,飽和濕度恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48h后更換感染和壞死,療效仍不佳。近年來,骨髓間充質(zhì)干細胞(mes—培養(yǎng)基。去除未貼壁細胞,以后視細胞生長情況每3—5d換enchymalstemcells.MSCs)移植治療急性胰腺炎的實驗研究液1次。待貼壁細胞約90%時,用0.25%的胰蛋白酶消化,按認為MSCs可
3、分化為有功能的胰腺干細胞,對損傷的胰腺進1:2傳代后繼續(xù)培養(yǎng),用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)。取第行修復(fù)。為治療重癥SAP提供了一種新的思路和手段,而細3代細胞.分別與一抗(抗CD29、CD34、CD44、CD45單克隆胞移植后在活體內(nèi)示蹤成為隨之而來的研究難點。近年來,抗體)室溫反應(yīng)30min,PBS液洗滌后重懸細胞,1%多聚甲醛隨著超順磁性氧化鐵(SPIO)納米顆粒標(biāo)記細胞技術(shù)的成熟,固定15min,然后進行流式細胞儀檢測。磁共振成像(MRI)活體示蹤SPIO標(biāo)記細胞成為新的研究熱1.4MSCs的磁標(biāo)記:多聚左旋賴氨酸(PLL)與SHO混懸點【=I]
4、。本實驗擬采用SPIO標(biāo)記兔MSCs并移植入SAP模型兔于培養(yǎng)液中(PLL和SPIO的終濃度分別為1.5I~g/ml和250行MRI掃描.探討干細胞移植治療SAP過程中,MRI活體示Ixg/m1),將SPIO.PLL復(fù)合物分別以1:4與培養(yǎng)基混合,使鐵蹤移植干細胞的可行性。的終濃度為50Ixg/ml,加入到第3代MSCs培養(yǎng)液中進行標(biāo)1材料和方法記,置于37℃、體積分數(shù)為5%CO:培養(yǎng)箱中孵育過夜。以未1.1實驗動物:選12只體質(zhì)量600~700g的健康新西蘭大標(biāo)記細胞作為對照組。白兔,雌雄不拘,由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。1.5建立模型:參照文獻
5、[4]建立SAP模型,將實驗兔固定1.2主要試劑和設(shè)備:SPIO納米顆粒為德國Schering公司后常規(guī)消毒、鋪巾,在無菌條件下,模型兔沿腹門線正中切口生產(chǎn)的Resovist:1.4ml/支.含鐵濃度0.5mmol/ml,鐵顆粒直進腹,暴露胰十二指腸及膽總管。找到十二指腸乳頭部,給予徑(5O±5)nm。德國Siemens公司的1.5TSonataMRI系統(tǒng)。美絲線縫扎(胰管結(jié)扎),膽總管中段絲線結(jié)扎,結(jié)扎處上段置國Hyclone公司的達氏修正伊氏培養(yǎng)基(DMEM),杭州四季人頭皮針尾部的塑料管,引流膽汁。乳頭縫扎處上段同樣置青生物工程材料有限公司的胎牛
6、血清,天津化學(xué)試劑三廠的人頭皮針尾部的塑料管作為胰膽管引流管。用2ml注射器從普魯士藍。膽總管引流管抽取膽汁,注入胰膽管引流管,動脈夾夾閉此1.3MSCs的體外分離、培養(yǎng)、傳代和鑒定:用3%戊巴比妥鈉引流管5~10min,完成胰腺炎模型制作。30mg/kg經(jīng)兔耳緣靜脈麻醉,無菌操作下,分別在雙側(cè)髂骨1.6移植細胞和MRI:造SAP模型后隨機分為2組.每組6上部穿入骨髓穿刺針,共抽取骨髓3~4ml。將抽取的骨髓加只。SAP造模后第2天,經(jīng)兔耳緣靜脈各組分別注入細胞懸入到含5ml磷酸鹽緩沖液(PBS)的無菌離心管中,充分混液和PBS液。實驗組:用微量注射器
7、將含有1xl06個SPIO標(biāo)勻。常溫下2000r/min離心15min,吸棄上清及脂肪層,再加記的MSCs的細胞懸液50l緩慢注入;對照組:注射入50入4mlPBS液,充分混勻。將上述懸液緩慢加到含4ml比重IxlPBS液。隨機抽取各組模型兔,在細胞移植后5、10、15d1.077g/LPereoll淋巴細胞分離液的無菌離心管中。常溫下以分別進行MRI。2000r/rain離心15min,可見離心管內(nèi)液體分為3層。收集中1.7損傷組織普魯士藍染色:模型兔經(jīng)MRI后處死,取胰腺組織。將胰腺組織塊置入4%多聚甲醛溶液中浸泡、固定,然DOI:10.11655
8、/zgywylc2013.11.010后經(jīng)沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片,行普魯士藍染色。