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1、雞新城疫的實(shí)驗(yàn)室診斷及免疫效果的評(píng)價(jià)目的1、掌握雞新城疫的臨診要點(diǎn)。2、了解和掌握雞新城疫的實(shí)驗(yàn)室診斷和免疫監(jiān)測(cè)技術(shù)。內(nèi)容1、雞新城疫的臨診要點(diǎn)。2、雞新城疫的實(shí)驗(yàn)室診斷。NDV的分離及鑒定；NDV毒力的鑒定3、雞新城疫的免疫效果評(píng)價(jià)雞新城疫的免疫監(jiān)測(cè)血凝試驗(yàn)(HA)和血凝抑制試驗(yàn)(HI)血凝試驗(yàn)（HA）和血凝抑制試驗(yàn)(HI)HA和HI的原理⒈HA試驗(yàn)：許多病毒表面有血凝素，能與各種動(dòng)物的紅細(xì)胞表面受體結(jié)合，而出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，簡(jiǎn)稱為病毒的血凝現(xiàn)象。2.HI試驗(yàn)：病毒的紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，可以被特異性免疫血清所抑
2、制，稱HI試驗(yàn)。一、雞新城疫的血凝試驗(yàn)(HA)【材料】新城疫病毒雞胚接種尿囊液1份0.5％雞血球懸液1管生理鹽水或PBS1瓶96孔微量血清盤(pán)1塊微量加樣器1支一、雞新城疫的血凝試驗(yàn)(HA)【方法與步驟】（一）制備雞紅細(xì)胞懸液：1.用注射器抽取抗凝劑。2.用上述注射器，采用無(wú)菌法抽取健康的未免疫雞的靜脈血。3.混勻，加生理鹽水適量，洗滌離心，共離心三次（第一、二次2000轉(zhuǎn)/分5分鐘、第三次3000轉(zhuǎn)/分5分鐘）洗去血清及白細(xì)胞。⒋取純紅細(xì)胞0.6ml，加生理鹽水稀釋99.4ml，即成1%的雞紅細(xì)胞懸液。一、雞新
3、城疫的血凝試驗(yàn)(HA)（二）加樣1.在96孔微量反應(yīng)板上進(jìn)行，自左至右各孔加50?L生理鹽水。2.于左側(cè)第1孔加50?L病毒液，混合均勻后，吸50?L至第2孔，依次倍比稀釋至第11孔，吸棄50?L；第12孔為紅細(xì)胞對(duì)照。3.自右至左依次向各孔加入0.5%雞紅細(xì)胞懸液50?L，在振蕩器上振蕩，室溫下靜置后觀察結(jié)果。一、雞新城疫的血凝試驗(yàn)(HA)【病毒血凝試驗(yàn)的操作方法（單位：?L）】孔號(hào)123456789101112病毒稀釋度1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:
4、2048對(duì)照生理鹽水505050505050505050505050病毒液50505050505050505050500.6%紅細(xì)胞505050505050505050505050微型振蕩器1min，靜置30min棄50結(jié)果觀察+++++++++++++++++++++++++++++++++--以100%凝集的病毒最大稀釋度為該病毒血凝價(jià)，即為一個(gè)凝集單位一、雞新城疫的血凝試驗(yàn)(HA)【結(jié)果判定】置于振蕩器上振蕩1分鐘，靜置后30min開(kāi)始觀察結(jié)果，待對(duì)照孔紅細(xì)胞已沉淀即可進(jìn)行結(jié)果觀察。紅細(xì)胞全部凝集，沉于孔
5、底，平鋪呈網(wǎng)狀，即為100%凝集（++++），不凝集者（-）紅細(xì)胞沉于孔底呈點(diǎn)狀。以100%凝集的病毒最大稀釋度為該病毒血凝價(jià)，即為一個(gè)凝集單位。從表4-1看出，該新城疫病毒液的血凝價(jià)為1:128，則l:128為1個(gè)血凝單位，1:64、l:32分別為2、4個(gè)血凝單位，或?qū)?28/4=32，即1:32稀釋的病毒液為4個(gè)血凝單位。二、雞新城疫的血凝抑制試驗(yàn)(HI)【材料】除血球凝集試驗(yàn)所用材料外，血清取雞免疫血清。雞群卵黃抗體的制備1.取雞蛋卵黃20ml，加入等量生理鹽水，振蕩，搖勻。2.加入等量氯仿40ml，振蕩
6、30分鐘。3.取振蕩的卵黃液3000～4000rpm30分鐘。4.取上清液作為抗體檢測(cè)材料二、雞新城疫的血凝抑制試驗(yàn)(HI)【方法】1.根據(jù)HA試驗(yàn)結(jié)果，確定病毒的血凝價(jià)，配制出4個(gè)血凝單位的病毒液。2.在96孔微量反應(yīng)板上進(jìn)行，用固定病毒稀釋血清的方法，先在第1孔加50?L生理鹽水。3.自第3孔至12孔各加50?L4個(gè)血凝單位的新城疫病毒液。4.第１孔加被檢雞血清50?L，吹吸混合均勻，吸50?L至第2孔，依此倍比稀釋至第10孔，吸棄50?L，稀釋度分別為：1:２、1:4、1:8……；第12孔加新城疫陽(yáng)性血清
7、50?L，作為血清對(duì)照。振蕩混合均勻，置室溫中作用20min。5.自第l孔至12孔各加0.5%雞紅細(xì)胞懸液50?L，振蕩混合均勻，室溫下靜置30-40min后觀察結(jié)果二、雞新城疫的血凝抑制試驗(yàn)(HI)孔號(hào)滴度lg2材料12345678910111212345678910病毒對(duì)照對(duì)照8單位病毒504單位病毒50505050505050505050生理鹽水50被檢雞血清50505050505050505050棄500.6%紅細(xì)胞505050505050505050505050震蕩混勻，室溫30-40min結(jié)果觀察-
8、-----++++++++++++++++++【病毒血凝抑制試驗(yàn)的操作方法（單位：?L）】以100％抑制凝集（完全不凝集）的被檢血清最大稀釋度為該血清的血凝抑制效價(jià)，即HI效價(jià)。二、雞新城疫的血凝抑制試驗(yàn)(HI)【結(jié)果判定】以100％抑制凝集（完全不凝集）的被檢血清最大稀釋度為該血清的血凝抑制效價(jià)，即HI效價(jià)。凡被已知新城疫陽(yáng)性血清抑制血凝者，該病毒為新城疫病毒。從表4-2看出，該血清
