實驗十 琥珀酸脫氫酶的作用及其競爭性抑制.doc

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1、實驗十琥珀酸脫氫酶的作用及其競爭性抑制一、實驗?zāi)康?、掌握競爭性抑制概念及作用機理。2、了解在無氧情況下觀察脫氫酶作用的簡單方法。二、實驗原理存在于心肌、骨骼肌、肝臟等組織中琥珀酸脫氨酸，能使琥珀酸脫氫而成延胡索酸，脫下氫可使甲烯藍退色，還原為甲稀白。反應(yīng)如下：草酸、丙二酸等在結(jié)構(gòu)上與琥珀酸相似，可與琥珀酸競爭與琥珀酸脫氫酸的活性中心結(jié)合。若酶已與丙二酸等結(jié)合，則不能再與琥珀酸結(jié)合而使之脫氫，產(chǎn)生抑制作用，且抑制程度取決于琥珀酸與抑制劑在反應(yīng)體系中濃度的相對比例，所以這種抑制是競爭性抑制。本實驗通過觀察在由不同濃度的琥珀酸與丙二酸組成的反應(yīng)體系中使

2、等量甲稀藍退色反應(yīng)時間，從而驗證丙二酸對琥珀酸的競爭性抑制作用。這樣，便可以顯示琥珀酸脫氫酶的作用。三、實驗儀器、材料和試劑1、儀器：恒溫水浴鍋，研缽或組織勻漿機2、材料和試劑（1）新鮮兔肝（2）0.10mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.4）：0.1mol/LNaH2PO419ml加0.1mol/LNa2HPO481ml。（3）0.093mol/L琥珀酸鈉溶液：取琥珀酸鈉1.5g溶于100ml蒸餾水中。（4）0.10mol/L丙二酸鈉溶液：取丙二酸鈉1.5g溶于100ml蒸餾水中。（5）0.02%甲稀藍溶液。（6）液體石蠟。四、實驗操作新鮮兔肝立即剪

3、碎，放于組織勻漿機中研碎，加入pH7.4的0.10mol/L磷酸鹽緩沖液，制備成200g/L的肝勻漿液備用。取五支試管分別編號，按下表配制反應(yīng)體系：試劑管號0.093mol/l琥珀酸鈉0.10mol/l丙二酸鈉0.10mol/l(pH7.4)磷酸緩沖液肝勻漿液0.02%甲烯藍1——1ml2ml1ml3滴21.5ml0.5ml1ml1ml3滴31ml1ml2ml——3滴42ml——1ml1ml3滴51ml1ml1ml1ml3滴將各管溶液混勻后加一薄層液體石蠟后靜置（此時不可搖動!），觀察各管中的顏色變化，并記錄各管顏色完全變化的時間。思考題:1、抑制

4、的分類及其特點？2、本實驗中液體石蠟起什么作用?本實驗需在無氧條件下進行,可加一層液體石蠟以隔絕空氣。3、各管中的反應(yīng)體系配好后為什么不能再搖動?4、制備肝漿時用磷酸緩沖液，可否換用蒸餾水，為什么？