琥珀酸脫氫酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制.ppt

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1、琥珀酸脫氫酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制制作人：王承強(qiáng)，汪強(qiáng)，杜金紅問(wèn)題琥珀酸脫氫酶是哪個(gè)代謝途徑中的酶，該酶位于細(xì)胞的什么部位？催化什么化學(xué)反應(yīng)？實(shí)驗(yàn)方案是如何設(shè)計(jì)檢查該酶的活性狀況？何為競(jìng)爭(zhēng)性抑制？本次試驗(yàn)中選擇的抑制劑是什么？如何設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案檢測(cè)該酶被抑制的程度？實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)動(dòng)物的處死與組織勻漿的方法學(xué)習(xí)離心機(jī)的使用方法進(jìn)一步理解酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制原理實(shí)驗(yàn)原理：競(jìng)爭(zhēng)性抑制是指分子結(jié)構(gòu)與底物相似的抑制劑可與底物競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合酶的活性中心，抑制酶的活性。競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的抑制程度取決于抑制劑與酶的親和力及于底物的相對(duì)比例。草酸與琥珀酸分子結(jié)構(gòu)相似，是琥珀酸脫氫酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。琥珀酸脫氫酶催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸。

2、在體內(nèi)琥珀酸脫下的2H經(jīng)電子傳遞鏈傳遞，最后與氧結(jié)合生成水，并釋放能量。在體外則可用甲稀蘭作為受H體，甲稀蘭接受琥珀酸脫下的2H而被還原為甲白，由藍(lán)色變?yōu)闊o(wú)色。在甲稀蘭含量一定的條件下，藍(lán)色消退的快慢程度可指示琥珀酸脫氫酶的活性，因此，可以依據(jù)藍(lán)色消退的時(shí)間來(lái)判斷該酶活性被抑制的程度。離心分離的原理：將處于懸浮狀態(tài)的細(xì)胞，細(xì)胞器，病毒和生物大分子等稱為“顆?！保總€(gè)顆粒都有一定大小，形狀，密度和質(zhì)量。當(dāng)離心機(jī)轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)時(shí)這些顆粒在介質(zhì)中發(fā)生沉降或漂浮，它的沉降速度與作用在顆粒上的力的大小和方向有關(guān)。實(shí)驗(yàn)器材與試劑：器材：小白鼠，研缽，手術(shù)剪，手術(shù)鑷子，2ml移液管，10ml離心管，低速離心機(jī)

3、試劑pH7.4磷酸緩沖液0.25%琥珀酸鈉溶液0.5%草酸鈉溶液0.01%甲稀蘭溶液生理鹽水實(shí)驗(yàn)操作肝糜液的制備：用頸椎脫臼法處死小白鼠，立即剖腹將肝臟全部取出，用生理鹽水洗凈肝臟，充分研碎至糊狀，然后分批加入少量磷酸緩沖液，邊加邊磨，總共加入7ml，攪拌后離心約5分鐘（3000rpm）,將上清液倒入另一試管鐘備用，此即為含有琥珀酸脫氫酶的肝糜液。另取5支試管，標(biāo)號(hào)，按下表操作試劑1號(hào)管2號(hào)管3號(hào)管4號(hào)管5號(hào)管0.25%琥珀酸鈉液（ml）0.5—0.520.50.5%草酸鈉溶液（ml）—0.50.50.52蒸餾水（ml）221.5——肝糜液（ml）11111甲稀蘭（ml）0.20.20.20.

4、20.2搖勻，靜置于37℃的水浴中，注意觀察各試管的顏色變化。記錄各管顏色消退的順序和時(shí)間，并進(jìn)行分析。注意事項(xiàng)：肝臟一定要充分研磨至糊狀，以使琥珀酸脫氫酶盡量釋放到溶液中。離心時(shí)注意離心管一定要精確平衡，并將重量相同的離心管對(duì)稱放置。（用天平精密平衡離心管和它們的內(nèi)容物，若有套筒，離心管應(yīng)與套筒一起平衡，否則輕者造成離心機(jī)損壞，重者會(huì)引起人員傷亡）（平衡后應(yīng)對(duì)稱放置，不能錯(cuò)位，以免因離心所產(chǎn)生的離心力不對(duì)稱而損壞離心軸）離心結(jié)束后拿取離心管時(shí)動(dòng)作要輕柔，不能震蕩離心管，以免肝糜液重新變渾濁。反應(yīng)開(kāi)始后，反應(yīng)液必須靜止，不能再搖動(dòng)。