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《實(shí)驗總結(jié)的幾種高效釀酒酵母轉(zhuǎn)化方法.docx》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、電轉(zhuǎn)法設(shè)計方案一：感受態(tài)制備：1.挑一環(huán)酵母菌接種于5mLYEPD培養(yǎng)基中，30℃、250-300rpm培養(yǎng)過夜；2.取1mL一級種子分別接種于兩瓶50mLYEPD培養(yǎng)基中，30℃、250-300rpm培養(yǎng)約16-18h(OD:1.3-1.5)；3.于4℃離心收集菌體，用25mL冰無菌水洗滌一次后，細(xì)胞用10ml冰無菌水重懸，可換成較小的離心管；4.加入1ml，pH7.5，10×TE緩沖液，搖晃均勻，再加入1ml10×LiAc，旋轉(zhuǎn)搖勻，于30度輕輕搖動45min；5.再加入0.4ml1mol/LDTT，并同時旋轉(zhuǎn)搖動，于30度輕
2、輕搖動15min；6.于4℃離心，棄上清（用槍吸），再用25mL冰無菌水洗滌；7.2.5ml冰冷的1mol/L山梨醇洗滌，離心收集菌體，棄上清（用槍吸）；8.每管用100ul山梨醇溶解，分裝于EP管中（80ul/管），于-70℃冰箱保存。電轉(zhuǎn)化：1．向感受態(tài)細(xì)胞中加入約5～10ug（體積小于10ul）的DNA，用槍吹吸均勻，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，靜置5min；2．擦干電轉(zhuǎn)杯，電擊，電擊參數(shù)：1.5KV，25uF，200歐姆；3．立即加入1ml預(yù)冷的山梨醇，轉(zhuǎn)移至EP管中，于30℃靜置1h；4．離心，棄上清，加入1mLYEPD后，于
3、30℃、200rpm培養(yǎng)2h；5．離心得菌體后，吸除550ul上清液，然后按150ul/板進(jìn)行涂板。說明：該方法可直接采用50或100mL體系的一步法，即直接挑單菌落于YEPD中培養(yǎng)至預(yù)定菌濃，也可采用試管搖菌收集菌體制備感受態(tài)。設(shè)計方案二：感受態(tài)制備：1.挑一環(huán)酵母菌接種于5mLYEPD培養(yǎng)基中，30℃、250-300rpm培養(yǎng)過夜；2.取1mL一級種子分別接種于兩瓶50mLYEPD培養(yǎng)基中，30℃、250-300rpm培養(yǎng)約16-18h(OD:1.3-1.5)；3.于4℃，5000rpm，5min離心收集菌體，用25mL冰無菌
4、水洗滌后，細(xì)胞重懸于8ml處理液中（處理液配方：100mMLiAc，10mMDTT，0.6M山梨醇，10mMTris-HCl，pH7.5），室溫靜置30min；4.4℃，5000rpm，5min離心收集菌體，用1.5mL1mol/L預(yù)冷的山梨醇洗滌三次，離心條件一樣；5.每管用100ul山梨醇溶解（以黃槍頭能吸取為宜，菌濃低時可適量少加入山梨醇），最后以80ul的終體積轉(zhuǎn)移至EP管中（菌體太多可適當(dāng)放棄部分），置于-70℃冰箱保存。電轉(zhuǎn)化：1.向感受態(tài)細(xì)胞中加入約3ug（體積小于10ul）的DNA，用槍吹吸均勻，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯
5、中，靜置5min；2.擦干電轉(zhuǎn)杯，電擊，電擊參數(shù)：2.0KV，25uF，200歐姆；3.立即加入1ml預(yù)冷的山梨醇，轉(zhuǎn)移至EP管中，于30℃靜置1h；1.離心，棄上清，加入1mLYEPD后，于30℃、200rpm培養(yǎng)2h；2.離心得菌體后，吸除550ul上清液，然后按150ul/板進(jìn)行涂板。說明：處理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT單獨(dú)于-20度保存，可配成100倍的貯備液。制備體系可按比例放大。設(shè)計方案二特別適合于采用一步法制備感受態(tài)細(xì)胞具體如下：1.挑一環(huán)酵母菌接種于5mLYEPD培養(yǎng)基中或轉(zhuǎn)接于50m
6、LYEPD中，在30℃、250-300rpm條件下培養(yǎng)至OD=6-10（為防止菌體老化，可將50mL培養(yǎng)體系提早收獲細(xì)胞，取菌體時，以1mL/次，取菌兩次或三次不等，使用菌濃達(dá)到預(yù)定的OD:6-10）；2.取1mL菌液分裝于EP管中，于4℃，12000rpm離心30s，棄上清；3.收集菌體，用預(yù)冰的無菌水洗滌兩次，離心條件一樣；4.所得菌體用1mL處理液（配方同上）于室溫下處理30min；5.離心，棄上清，加入1ml1M預(yù)冷山梨醇，離心，棄上清，重復(fù)兩次；6.最終用1M預(yù)冷山梨醇溶解菌體至終體積為80ul，于-70℃冰箱保存；7.
7、電轉(zhuǎn)方法同上。8.每一步的離心均30s即可，在較短的時間內(nèi)制備出的感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率特別高。備注：OD檢測均為600nm，空白參比為：YEPD，高濃測定時應(yīng)稀釋測定。所有無菌水與山梨醇均在冰上預(yù)冷處理；在制備感受態(tài)階段，所有離心均在4℃條件下。醋酸鋰轉(zhuǎn)化法方案一：1.挑一環(huán)酵母菌接種于5mLYEPD培養(yǎng)基中，30℃、200rpm培養(yǎng)過夜；2.取1mL一級種子分別接種于兩瓶50mLYEPD培養(yǎng)基中，30℃、250-300rpm培養(yǎng)約5h(OD:0.5-0.8)；3.于4℃，5000rpm，5min離心收集菌體；4.25mL冰無菌水洗滌兩
8、次，離心條件一樣；5.用1mL0.1MLiAc懸浮，離心收集菌體；6.再用0.5mL0.1MLiAc懸浮，以50ul/管分裝于EP管中，置于冰上備用；7.依次向上述50ul感受態(tài)細(xì)胞中加入50%PEG3350：240ul、1MLiCl：36ul、2
