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1、核酸檢測在血液篩查中的應(yīng)用深圳市血液中心血液篩查是否需要進行核酸檢測無償獻血的新動態(tài)“定期無償獻血者是低危的獻血者”，但是“以體檢為目的定期無償獻血者是高危獻血者”而且這部分人群的獻血隊伍正在擴大。這部分人群窗口期的機率高于其他人群。因為在他們中間高危的傳播行為經(jīng)常發(fā)生。經(jīng)過治療后的HBsAg轉(zhuǎn)陰，ELISA方法檢測陰性的獻血者。NAT與ELISA互補病毒變異免疫靜默期實驗操作失誤病毒感染的窗口期病毒檢測窗口期項目ELISA窗口期項目NAT窗口期HBsAg56HBV25抗-HCV72HCV59抗-HIV
2、22HIV11血篩用NAT試劑與臨床用的不同目的和要求不同定性與定量臨床使用核酸檢測主要目的是定量監(jiān)測，進行療效分析。血篩用于病原體的定性篩查靈敏度和特異性臨床在漏檢與誤差之間更重視誤差血液篩查用核酸目的是保證用血安全，更重視漏檢質(zhì)控要求不同臨床用與血液篩查用質(zhì)控要求也不同。臨床試劑以定量準(zhǔn)確和防止誤報為質(zhì)控目標(biāo)血篩用以防止漏檢為主要目的陽性率也不同臨床更多的陽性；血篩更多是陰性對自動化要求不同臨床更多用于病人,單人份檢測,標(biāo)本量少血篩更多用于正常人，因此檢測量不同，對自動化的要求也不同血篩用NAT平臺
3、的要求靈敏度HBV≤10IU/ml；HCV、HIV≤200IU/ml特異性核酸的特異性高，幾乎沒有方法學(xué)假陽性但要防止污染內(nèi)標(biāo)（內(nèi)對照）為避免假陰性，要求每管陽性質(zhì)控自動化大規(guī)模、高通量關(guān)于靈敏度的幾個問題廠家宣傳的靈敏度均指單人份檢測，而非推薦pooling方案的實測靈敏度實際應(yīng)用靈敏度=宣傳靈敏度×pooling數(shù)IU才有可比性：WHO標(biāo)準(zhǔn)品以及國家一級標(biāo)準(zhǔn)品均以IU為單位HCV、HIV窗口期濃度高，因此對靈敏度要求較低。美國FDA要求，HCV、HIV5000IU/ml能在pooling方案中被檢出
4、HBV的窗口期標(biāo)本在30-300IU/ml之間，因此對靈敏度要求高低于靈敏度也有檢出的可能，這與取樣幾率有關(guān)血液篩查常用的NAT技術(shù)核酸提取均使用磁珠法磁珠提取的原理：將磁珠上標(biāo)記特異性吸附核酸的物質(zhì)特異性吸附核酸，并通過磁分離技術(shù)將病毒核酸從裂解液中提取出來步驟：裂解—吸附—洗滌—洗滌—洗滌—洗脫優(yōu)點：磁珠提取特異性高，受標(biāo)本因素影響小，靈敏度高易于實現(xiàn)自動化缺點：成本較高、并需要一定的儀器(半自動、全自動)。完全手工工作量太大實時熒光定量PCR技術(shù)原理所謂的實時熒光定量PCR就是通過對PCR擴增反應(yīng)
5、中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測從而實現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。在實時熒光定量PCR反應(yīng)中,引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。實時熒光優(yōu)點特異性好引物、探針雙重保證特異性方法學(xué)假陽性很少擴增檢測同時進行，速度快，且不對擴增產(chǎn)物進行處理，不易污染熒光檢測靈敏度高羅氏第二代的NAT試劑也是使用實時熒光檢測內(nèi)標(biāo)設(shè)計原理內(nèi)標(biāo)為一已知
6、低含量的與模板擴增效率相似的一段DNA片段，將它加入PCR反應(yīng)液中，與模板共同擴增，以反應(yīng)每管真實的擴增情況，如果內(nèi)標(biāo)和樣品都未擴增出結(jié)果，則表示該管擴增無效，應(yīng)重新做。樣本內(nèi)標(biāo)內(nèi)標(biāo)的作用：避免假陰性內(nèi)標(biāo)的種類：同源、異源內(nèi)標(biāo)的作用：真實反應(yīng)擴增效率避免假陰性：假陰性是目前血液篩查中最重視的問題之一，內(nèi)標(biāo)全程進行質(zhì)量監(jiān)控質(zhì)控核酸檢測中遇到的問題 與解決方案人員素質(zhì)和清潔很重要血篩用NAT對低濃度要求太高，高靈敏度的試劑操作對人員要求高，同樣的平臺不同的實驗員有很大的差距。平臺建立初期會有較大問題對人員素
7、質(zhì)要求與自動化程度成反比實驗室及儀器清潔很重要由于少有高濃度標(biāo)本，因此大面積的污染不易發(fā)生。但由于試劑靈敏度高，如不隨時注意清潔，污染有積累效應(yīng)，會出現(xiàn)散發(fā)性樣本污染，引起假陽性采血樣管的處理玻璃器皿在使用前應(yīng)高壓處理，因為玻璃器皿常含有不易失活的RNA酶。最好是熱滅菌，250℃烘烤4小時以上可使RNA酶永久性失活。異硫氰酸胍鹽(Guanidinethiocyanate,GITC)可使DNA酶和RNA酶立即失活。標(biāo)本匯集利用STAR工作平臺,編制匯集軟件。合理的Pooling方案Pooling方案靈敏度
8、因素檢出血液中最低的病毒含量與標(biāo)本匯集數(shù)量呈正比成本因素試劑價格以test為單位，檢測單位成本與pooling方案有關(guān)檢測標(biāo)本量及檢測時間因素擴增檢測量=提取量×3(HBV、HIV、HCV)與儀器密切相關(guān)影響靈敏度因素Pooling方案內(nèi)標(biāo)的濃度標(biāo)本的加樣量磁珠的量和混勻模板制作過程的損失和提取量批質(zhì)控的選用及設(shè)定使用低濃度樣本為批陽性質(zhì)控由于有內(nèi)標(biāo)進行每管陽性質(zhì)控，因此批陽性質(zhì)控主要目的是監(jiān)控實驗細微的系統(tǒng)誤差。因此陽性質(zhì)控濃度選擇要低過
