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《正交設(shè)計法優(yōu)化川木通rapd》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。
1、正交設(shè)計法優(yōu)化川木通RAPD作者:國錦琳,陳璐,任艷,裴瑾,萬德光【摘要】目的確定川木通rapd-pcr反應(yīng)各因素的最佳水平,最終確定rapd-pcr反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件。方法采用正交設(shè)計l16(45)在4個水平上對川木通類植物進行rapd-pcr進行試驗。兩次結(jié)果分別用統(tǒng)計軟件minitab進行分析。結(jié)果最終確定rapd-pcr反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件為:20μl體系,其中含1×pcrbuffer,2.5mmol/lmgcl2,0.15mmol/ldntps,1.0utaq酶,0.5μmol/l10-mer引物,50ng模板dna,最終確定退火溫度36℃。同時發(fā)現(xiàn)taq酶對反應(yīng)體系影響最大。結(jié)
2、論建立了可靠的反應(yīng)體系,為該類藥材的分子鑒定奠定了基礎(chǔ)。【關(guān)鍵詞】正交設(shè)計;川木通;rapd-pcr川木通類藥材均來自于毛茛科鐵線鏈屬植物,該屬植物我國共分布有108個種[1],有些鐵線蓮屬藥用植物外形極為相似,有時非花期植株難以鑒別,經(jīng)過藥材加工后更加難以辨別,容易在應(yīng)用中造成品種混亂,影響臨床用藥安全與療效。.因此,在具體開發(fā)使用本屬藥用植物資源時,應(yīng)重視和加強對其品種的鑒定,以確保資源的正確合理使用。rapd繼承了pcr技術(shù)效率高,樣品用量少(只需少量dna樣品),靈敏度高,檢測容易等優(yōu)點[2],目前被廣泛地應(yīng)用于藥用植物的分類鑒定工作。但pcr各因素水平對反應(yīng)結(jié)果均有影響。目前關(guān)
3、于川木通rapd-pcr的反應(yīng)體系優(yōu)化未見報道,本實驗采用正交設(shè)計l16(45)在4個水平上對川木通類植物進行rapd-pcr進行試驗,建立了較為可靠的反應(yīng)體系。本工作為以后該類植物與藥材的分子鑒定奠定了基礎(chǔ)?! ?材料本實驗所使用的川木通原植物均為作者在四川各地實地采集,植物葉片采集后采用硅膠直接干燥,另外部分采集后直接編號用液氮保存,此后保存在-80℃冰箱備用,所采集植物均經(jīng)過萬德光教授鑒定后備用?! aq聚合酶、dntp、t4連接酶、瓊脂糖購自takara寶生物工程(大連)有限公司;rapd引物購自北京賽百盛公司?! ?方法 2.1植物總dna的小規(guī)模提取與dna濃度的測定提取
4、方法按干滟等[3]的方法并稍加改進。測定濃度后稀釋至50ng/μl?! ?.2pcr反應(yīng)因素水平的確定與正交表的設(shè)計[4]為了確定pcr反應(yīng)中的5個因素(taq酶、mg2+、模板dna、dntp、引物)的最佳水平,采用正交設(shè)計l16(45)在4個水平上進行實驗。參加pcr反應(yīng)的因素水平見表1,l16(45)設(shè)計方案見表2。表1pcr反應(yīng)的因素水平μl水平(略)表2pcr反應(yīng)的因素水平l16(45)正交實驗設(shè)計μl(略) 將表2的16個處理重復(fù)兩次,在pcr儀上進行擴增,結(jié)果電泳檢測,記錄。用統(tǒng)計軟件minitab進行分析,得到川木通rapd-pcr反應(yīng)各因素的最佳水平,最后在pcr儀上
5、,用此最佳因素水平的pcr反應(yīng)體系進行梯度退火試驗,篩選得到最佳退火溫度?! ?.3rapd擴增在正交結(jié)果的基礎(chǔ)上,建立了本實驗所使用的體系[5,6]。rapd擴增反應(yīng)所采用的條件和體系如下:20μl體系,其中含1×pcrbuffer,2.5mmol/lmgcl2,0.15mmol/ldntps,1.0utaq酶,0.5μmol/l10-mer引物,50ng模板dna,補ddh2o至終體積20μl。pcr反應(yīng)熱循環(huán)程序如下:95℃預(yù)變性5min;36℃復(fù)性1min;72℃延伸1.5min;94℃變性1min;36℃復(fù)性1min;72℃延伸1.5min,35個循環(huán)。最后72℃延伸10min
6、,反應(yīng)產(chǎn)物在4℃保存。 2.4電泳分析與結(jié)果統(tǒng)計dna擴增產(chǎn)物在1×tae的緩沖條件下,于1.5%瓊脂糖凝膠分離,溴化乙錠染色。標準分子量為tokara提供的dl2000marker。使用凝膠成像系統(tǒng)(gds8000,美國uvp)拍照分析?! ?結(jié)果 3.1電泳結(jié)果評分按照表2設(shè)計的16個處理進行pcr反應(yīng)后,產(chǎn)物進行電泳。結(jié)果見圖1。 根據(jù)電泳結(jié)果,按照本實驗?zāi)康模匆院髮⒁M行的遺傳多樣性分析的要求將16個處理從高到低依次打分,條帶數(shù)量越豐富、清晰度越高、背景低的最佳產(chǎn)物記為16分,與此相反,最差的記為1分[7,8]。兩次重復(fù)分別獨立設(shè)計,從兩次重復(fù)的結(jié)果看,各個處理組合的反應(yīng)
7、都具有較高的一致性。兩次記分分別為1,13,14,11,10,16,15,12,2,9,8,7,6,5,4,3和1,12,14,13,10,16,11,15,2,8,9,7,5,6,4,3?! ?.2各因素對pcr反應(yīng)影響的差異分析將上述處理結(jié)果用統(tǒng)計軟件minitab(minitabinc.)進行方差分析。結(jié)果見表3。由f值可見,taq酶的影響最大,模板的影響最小,各因素對pcr反應(yīng)的影響由大到小依次為:taq酶、引物、mg2+、