質(zhì)粒dna的提取和鑒定

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1、綜合性設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)-6質(zhì)粒載體的選擇以及所插入的外源DNA片段序列的生物信息學(xué)分析質(zhì)粒DNA的提取與鑒定真核表達(dá)載體和RNA干擾載體的使用此實(shí)驗(yàn)共包括如下三個(gè)部分第一部分，質(zhì)粒載體的選擇以及所插入的外源DNA片段序列生物信息學(xué)分析部分第二部分，質(zhì)粒DNA的提取與鑒定實(shí)驗(yàn)操作部分第三部分，真核表達(dá)載體和RNA干擾載體的使用第一部分，質(zhì)粒載體的選擇以及所插入的外源DNA片段序列的生物信息學(xué)分析質(zhì)粒的基本知識(shí)載體（vector）：能攜帶外源DNA進(jìn)入細(xì)胞的運(yùn)載DNA分子。載體按其行使的功能分為克隆載體和表達(dá)載體，按組

2、成元件的來(lái)源不同分為質(zhì)粒載體、噬菌體載體、病毒載體等。質(zhì)粒（plasmid）大小在1kb～200kb之間，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，大多是具有雙鏈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的DNA分子，通常以超螺旋狀態(tài)存在于許多細(xì)菌和酵母菌中。質(zhì)粒具有不相容性，兩種不同的質(zhì)粒不能共存在同一個(gè)宿主細(xì)胞中。質(zhì)?？稍诩?xì)胞間傳遞，其在胞內(nèi)的存在一般對(duì)宿主細(xì)胞的代謝活動(dòng)無(wú)影響。質(zhì)粒有篩選標(biāo)記，能提示質(zhì)粒是否進(jìn)入宿主細(xì)胞，可明顯地區(qū)別于其它細(xì)胞，篩選標(biāo)記可為抗生素抗性基因或營(yíng)養(yǎng)缺陷型基因，這樣能改變宿主細(xì)胞的耐藥性，使宿主細(xì)胞在含抗菌素環(huán)境中生存，或宿主細(xì)胞在缺乏某

3、種營(yíng)養(yǎng)組分時(shí)候還能生存。質(zhì)粒含有啟動(dòng)子序列，能夠自我復(fù)制。不過(guò)質(zhì)粒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄都依賴于宿主編碼的蛋白和酶，或能在胞質(zhì)中進(jìn)行自我復(fù)制，或整合到細(xì)胞染色體中作為細(xì)胞遺傳物質(zhì)的一部分隨染色體一起復(fù)制。質(zhì)粒的特點(diǎn)使其成為攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的重要媒介物，這種基因運(yùn)載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價(jià)值。質(zhì)粒DNA能從細(xì)菌中提出來(lái)，又能再轉(zhuǎn)入細(xì)菌，這個(gè)過(guò)程稱轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒DNA仍能進(jìn)行復(fù)制，產(chǎn)生多個(gè)拷貝。5‘AOX1啟動(dòng)子片段含有AOX1啟動(dòng)子，在甲醇的誘導(dǎo)下可啟動(dòng)外源蛋白的表達(dá)；α-因子信號(hào)肽序列為約8

4、9個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列，能使外源蛋白分泌到發(fā)酵上清中，更利于外源蛋白的純化；多克隆位點(diǎn)含多個(gè)酶切位點(diǎn)，為外源基因的插入提供位點(diǎn)；TT序列提供有效的轉(zhuǎn)錄終止和polyA修飾信號(hào)；HIS4為營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)志；3‘AOX1基因片段能夠與基因組AOX1基因?qū)偻粗亟M；抗Amp基因和pBR322能使空載體和構(gòu)建的表達(dá)載體在E.coli中篩選和復(fù)制。以應(yīng)用于畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的pPIC9載體為例解釋載體的構(gòu)件根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要是否將片段進(jìn)行表達(dá)，將載體分為表達(dá)載體和克隆載體?？寺≥d體一般是將需要目的DNA片段與載體相連接，導(dǎo)

5、入原核細(xì)菌內(nèi)，使質(zhì)粒在原核細(xì)菌內(nèi)大量復(fù)制，得到大量的重組質(zhì)粒。常用的克隆載體有：pGEM-T,pBR322,pUC18/19表達(dá)載體一般是將需要目的DNA片段與載體相連接，導(dǎo)入原核細(xì)菌或真核細(xì)胞內(nèi)，使目的DNA片段在菌內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)得到轉(zhuǎn)錄與翻譯，得到目的蛋白。常用的表達(dá)載體：原核系統(tǒng)：pET系列，pQE系列，pGEX系列酵母表達(dá)系統(tǒng)：pPIC9，pPIC9k，pPICZ真核細(xì)胞系統(tǒng)：pCMVp-NEO-BAN，pEGFP，CMV4，pEGFT-Actin序列的查詢與獲得http://www.ncbi.nlm.n

6、ih.gov/輸入基因名稱選擇查詢項(xiàng)目點(diǎn)擊“Go”注意選擇人屬物種的基因蛋白質(zhì)序列mRNA序列基因組序列運(yùn)行DNAstar軟件點(diǎn)擊“OK”選取編碼區(qū)序列密碼子使用分析http://www.kazusa.or.jp/codon/countcodon.html輸入DNA序列得到的分析結(jié)果啟動(dòng)子區(qū)的分析http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.htmlCpG島分析http://www.prot

7、ocol-online.org/cgi-bin/prot/view_cache.cgi?ID=2943實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諌A裂解法提取質(zhì)粒的方法了解質(zhì)粒酶切鑒定原理第二部分，質(zhì)粒DNA的提取與鑒定方法：堿裂解法；煮沸裂解；羥基磷灰石柱層析法，質(zhì)粒DNA釋放法；酸酚法等。堿裂解法有操作簡(jiǎn)便、快速、得率高的優(yōu)點(diǎn)。概括起來(lái)主要是用非離子型或離子型去污劑、有機(jī)溶劑或堿進(jìn)行處理及用加熱處理所有分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)菌；分離質(zhì)粒DNA(有時(shí)還要求純化質(zhì)粒DNA，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需)選擇

8、哪一種方法主要取決于以下幾個(gè)因素：質(zhì)粒的大小、大腸桿菌菌株、裂解后用于純化的技術(shù)和實(shí)驗(yàn)要求。質(zhì)粒DNA的提取方法堿裂解法基本原理葡萄糖是使懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部，EDTA是Ca2+和Mg2+等二價(jià)金屬離子的螯合劑，其主要目的是為了螯合二價(jià)金屬離子從而達(dá)到抑制DNase的活性，避免質(zhì)粒被酶降解。NaOH主要是為了溶解細(xì)胞，釋放DNA，因?yàn)樵趶?qiáng)堿性的情況下，細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer