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《實(shí)驗(yàn)一質(zhì)粒DNA的提取和鑒定》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、質(zhì)粒DNA的提取和純化鄭敏生化與分子生物學(xué)系分子生物學(xué)從分子水平上研究生命現(xiàn)象物質(zhì)基礎(chǔ)的學(xué)科。研究細(xì)胞成分的物理、化學(xué)的性質(zhì)和變化以及這些性質(zhì)和變化與生命現(xiàn)象的關(guān)系，如遺傳信息的傳遞，基因的結(jié)構(gòu)、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、表達(dá)調(diào)控和表達(dá)產(chǎn)物的生理功能，以及細(xì)胞信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)等。基因工程移液器和EP管質(zhì)粒質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，獨(dú)立于染色體之外的、能自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀脫氧核糖核酸物質(zhì)。質(zhì)粒的存在使宿主具有一些額外的特性，如對抗生素的抗性等。F質(zhì)粒(又稱F因子或性質(zhì)粒)、R質(zhì)粒(抗藥性因子)和Col質(zhì)粒(產(chǎn)大腸桿菌素因子)等都是常見的天然質(zhì)粒。能穩(wěn)定
2、地獨(dú)立存在于染色體外，并傳遞到子代，一般不整合到宿主染色體上?，F(xiàn)在常用的質(zhì)粒大多數(shù)是經(jīng)過改造或人工構(gòu)建的，常含抗生素抗性基因，是重組DNA技術(shù)中重要的工具。分類：單拷貝質(zhì)粒；多拷貝質(zhì)粒；緊密控制型；松弛控制型；質(zhì)粒DNA的提取方法堿裂解法；煮沸裂解法；酚氯仿抽提法；概括起來主要是用非離子型或離子型去污劑、有機(jī)溶劑或堿進(jìn)行處理及用加熱處理。基本思路培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)菌；分離質(zhì)粒DNA(有時(shí)還要求純化質(zhì)粒DNA，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需)電泳檢測；堿裂解法的基本原理十二烷基磺酸鈉(SDS)可使細(xì)胞膜裂解。經(jīng)SDS處理后，細(xì)菌染色體DNA會(huì)纏繞附著在細(xì)胞
3、碎片上，同時(shí)由于細(xì)菌染色體DNA比質(zhì)粒大得多，易受機(jī)械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。當(dāng)用強(qiáng)熱或酸、堿處理時(shí)，細(xì)菌的線性染色體DNA變性，而共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(CovalentlyclosedcircularDNA，簡稱cccDNA)的兩條鏈不會(huì)相互分開。當(dāng)外界條件恢復(fù)正常時(shí)，線狀染色體DNA片段難以復(fù)性，而是與變性的蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片纏繞在一起，而質(zhì)粒DNA雙鏈又恢復(fù)原狀，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解狀態(tài)存在于液相中。實(shí)驗(yàn)步驟1、將含有質(zhì)粒DNA的細(xì)菌在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。取1.5mlLB培養(yǎng)液倒入1.5mleppendorf
4、管中，4℃下12000g離心30秒。2、棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘，使液體流盡。3、菌體沉淀重懸浮于100μl溶液Ⅰ中（需劇烈振蕩）。4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl，蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數(shù)次，以混勻內(nèi)容物（千萬不要振蕩），冰浴2分鐘。5、加入150μl預(yù)冷的溶液Ⅲ，蓋緊管口，顛倒混勻，冰浴中5分鐘，4℃下12000g離心10分鐘。6、上清液（450uL）移入干凈eppendorf管中，加入等體積的飽和酚（1:1），充分顛倒混勻，4℃下12000g離心10分鐘。7、將水相（400uL）移入干凈eppendorf管中，加入等
5、體積酚/氯仿，顛倒混勻，12000rpm離心10min。8、將水相（350uL）移入干凈eppendorf管中，加入2倍體積的無水乙醇，振蕩混勻后置于-20℃冰箱中20分鐘，然后4℃下12000g離心10分鐘。9、棄上清，將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出，加入0.5ml70％乙醇洗沉淀一次，4℃下12000g離心5-10分鐘。10、吸除上清液，將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡，真空干燥10分鐘或室溫干燥。11、將沉淀溶于10μlTE緩沖液（pH8.0，含20μg/mlRNaseA）中，儲(chǔ)于-20℃冰箱中。LB液體培養(yǎng)基（Luria-Bertani）
6、稱取蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl10g，溶于800ml去離子水中，用NaOH調(diào)pH至7.5，加去離子水至總體積1升，高壓下蒸氣滅菌20分鐘。溶液I50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0）。溶液Ⅰ可成批配制，每瓶100ml，高壓滅菌15分鐘，儲(chǔ)存于4℃冰箱溶液I：重懸細(xì)菌；葡萄糖：比重大，使細(xì)菌不易沉淀；Tris－HCl：緩沖體系；EDTA：螯合金屬離子；溶液Ⅱ0.2mol/LNaOH（臨用前用10mol/LNaOH母液稀釋），
7、1％SDS溶液II——破膜，變性基因組DNA和蛋白質(zhì)；SDS——破膜作用，變性蛋白質(zhì)；NaOH——破膜，變性基因組DNA；溶液Ⅲ5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O28.5ml，定容至100ml，并高壓滅菌。溶液終濃度為：K+3mol/L，Acˉ5mol/L。溶液III——中和溶液，復(fù)性質(zhì)粒DNA；酚/氯仿（1:1）酚——變性蛋白質(zhì)；氯仿——萃取溶液中的酚；分為兩層，上層為水層，下層為酚氯仿混合液。吸取時(shí)不要震蕩。乙醇無水乙醇（2倍體積）——沉淀質(zhì)粒DNA；70%乙醇——洗滌質(zhì)粒DNA沉淀，除去沉淀中的鹽分；核酸的定量260nm，1
8、OD值相當(dāng)于：雙鏈DNA濃度為50?g/ml單鏈DNA濃度為40?g/mlA260/A280=1.8（DNA
