微衛(wèi)星分子標(biāo)記開發(fā)操作指南

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1、微衛(wèi)星分子標(biāo)記開發(fā)操作指南1、250ngDNA酶切（DNA必須比較純）反應(yīng)體系：ddH2017.25μL10XbufferR2.5μLMseⅠ(10U/μL)0.25uL（2.5U）DNA(50ng/μL)5μL總反應(yīng)體系25μL,PCR儀內(nèi)37℃,3h酶切,65℃，15分鐘失活。電泳檢測(cè)：1.5%的瓊脂糖，150V電泳20min，點(diǎn)樣量約9μL-10μL，剩余的15μL用于連接。2、酶切后的產(chǎn)物連接。反應(yīng)體系：ddH208.8μLMseⅠ接頭1uM(3μL)即1pmol/μL0.405nmol/μl=405pmo

2、l/μlT4buffer3μLT4DNAligase(5U/μL)0.2μL(1u)酶切后DNA15μL總反應(yīng)體系30μL,PCR儀內(nèi)37℃,2h或21℃，過(guò)夜連接，65℃10min失活。MseⅠ接頭5’-TACTCAGGACTCAT-3’/5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’接頭：10μL100pmol/μL+90μLddH2O=100μL10pmol/μL3、連接的產(chǎn)物用滅菌蒸餾水稀釋10倍（10μL酶切產(chǎn)物+90μL水）4、稀釋的連接產(chǎn)物預(yù)擴(kuò)增。反應(yīng)體系：無(wú)菌水9.6μLTaqDNA聚合酶buffer

3、1X2μLMgCl21.5mM2μLMseⅠ-Nprimer120ng1μLdNTPs200uM0.2μLTaqDNA聚合酶0.4U0.2μL稀釋的連接產(chǎn)物5μL5μL總反應(yīng)體系20μL。反應(yīng)條件為：94℃30s，53℃60s，72℃60s，14-26個(gè)循環(huán)（循環(huán)數(shù)需優(yōu)化14-17-20-23-26）MseⅠ-N引物為：5’-GATGAGTCCTGAGTAAN-3’，N表示包括所有4種可能的選擇堿基N=A，T，C，G,1.5%瓊脂糖電泳檢測(cè)5、最佳反應(yīng)條件下，PCR重新擴(kuò)增一次，獲得幾百ng的擴(kuò)增產(chǎn)物，試劑盒純化。

4、6、雜交*5’端生物素化的探針的選擇：常見的幾種探針：（AC）15，（CT）15，（GA）15，（CAA）10，（AAG）8，（GATA）7，（ACCT）6*250ng-500ng擴(kuò)增的DNA與50-80pmol的生物素化的探針混合，加入總體積100μL的SSCX4.2和SDS0.07%中（即21μLSSCX10加0.7μLSDS10%，加水至100μL）。2μg的DNA與200pmol的探針在終體積500μL終濃度0.5XSSC溶液中，60℃雜交2小時(shí)。*95℃3min變性，室溫，15min退火7、富集純化的帶接

5、頭的DNA（2-2.5微克）約30-50μL，95℃變性5分鐘，與3’端生物素化的（CA）10或（GA）10或5’生物素化探針（60℃雜交2h）200pmol（1μL）在50℃0.5倍SSC雜交1.5h,加入600μL的磁珠重懸于100μL的0.5XSSC溶液中，室溫，20分鐘。300μL的預(yù)熱至50℃的0.1XSSC溶液洗2次300μL的0.1XSSC溶液室溫洗2次DNA洗脫至100μL的預(yù)熱至50℃的雙蒸水中，2次試劑盒操作說(shuō)明：輕彈管底，使磁珠重懸，用磁場(chǎng)吸附磁珠,小心去上清（不能離心!!）用300μL的0.

6、5XSSC溶液重懸并清洗磁珠，磁場(chǎng)吸附，去上清(重復(fù)2次)重懸于100μL的0.5XSSC,加入DNA探針混合物室溫溫育10分鐘，每1-2分鐘，倒置管子混勻吸附磁珠，去上清300μL的0.1XSSC溶液重懸并清洗磁珠，磁場(chǎng)吸附，去上清。重復(fù)3次，最后一次去上清盡量去干凈（洗完后的上清保留以便查找實(shí)驗(yàn)故障的原因）重懸于100μL的水中，輕彈管底是磁珠重懸磁場(chǎng)吸附磁珠，上清液（我們需要的產(chǎn)物）轉(zhuǎn)移至滅菌的管子中，保留磁珠。加入150μL的水，重復(fù)洗脫一遍，共得到250μL的產(chǎn)物富集*1mg的磁珠用TEN100（10mM

7、Tris-HCl,1mMEDTA,100mMNaCl,pH7.5）沖洗，重懸于40μL的TEN100中。*加入10μL（約1ug）的不相關(guān)的PCR產(chǎn)物（為了盡量減少非特異性結(jié)合的DNA）*DNA-探針混合物用300μL的TEN100稀釋*稀釋的DNA-探針混合物加入洗好的磁珠，室溫溫育30min，溫育過(guò)程中不時(shí)溫和攪拌(Incubateonrotator,orsidewaysinorbitalshakeronslowspeedat50for30min.)*15000轉(zhuǎn)，離心1min，（以便查找失敗原因）*非嚴(yán)格沖洗

8、：加入400μL的TEN1000（（10mMTris-HCl,1mMEDTA,1MNaCl,pH7.5）,室溫下輕柔混合5min，15000轉(zhuǎn)，離心1min，上清轉(zhuǎn)移至另一管中保存?zhèn)溆谩Ｖ貜?fù)2次。*嚴(yán)格沖洗：加入400μL的SSC0.2X，0.1%SDS，室溫下輕柔混合5min，15000轉(zhuǎn)，離心1min，上清轉(zhuǎn)移至另一管中保存?zhèn)溆?。重?fù)2次。8、加入50μ