大菱鲆微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)與其應(yīng)用

大菱鲆微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)與其應(yīng)用

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1、學(xué)校代碼:10264研究生學(xué)號:M100101037上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文題目:大菱鲆微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)與其應(yīng)用Isolationandapplicationof英文題目:microsatellitemarkersforTurbot(ScophthalmusmaximusL.)專業(yè):水產(chǎn)養(yǎng)殖研究方向:海水魚類遺傳改良研究姓名:李猛指導(dǎo)教師:馬愛軍研究員二0一三年四月十日大菱鲆微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)與其應(yīng)用學(xué)位論文完成日期:指導(dǎo)教師簽字:答辯委員會成員簽字:上海海洋大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明:我恪守學(xué)術(shù)道

2、德,崇尚嚴(yán)謹(jǐn)學(xué)風(fēng)。所呈交的學(xué)位論文,是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下,獨立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)明確注明和引用的內(nèi)容外,本論文不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品及成果的內(nèi)容。論文為本人親自撰寫,我對所寫的內(nèi)容負(fù)責(zé),并完全意識到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者簽名:日期:年月日上海海洋大學(xué)學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定,同意學(xué)校保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版,允許論文被查閱或借閱。本人授權(quán)上海海洋大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部

3、或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索,可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。保密□,在年解密后適用本版權(quán)書。本學(xué)位論文屬于不保密□學(xué)位論文作者簽名:指導(dǎo)教師簽名:日期:年月日日期:年月日上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文大菱鲆微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)與其應(yīng)用摘要1.利用FIASCO(FastIsolationbyAFLPofSequencesContainingrepeats)法篩選大菱鲆微衛(wèi)星DNA序列。先用MseI酶酶切大菱鲆的基因組DNA,加接頭,用M00通用引物PCR擴(kuò)增,建立小片段基因組文庫;再采用

4、以生物素標(biāo)記的(CA)12,(AC)17,(AG)17,(AT)17,(AAT)10,(AAC)10,(GACA)10,(GATA)10為寡核苷酸探針,與串聯(lián)重復(fù)序列雜交,構(gòu)建大菱鲆的微衛(wèi)星DNA富集文庫;與載體連接,轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)含氨芐的LB培養(yǎng)基培養(yǎng),初篩出2027個陽性菌落;經(jīng)三組PCR反應(yīng),二次篩選出655個克隆,富集效率為32.3%。測序后得到597條序列,經(jīng)分析76個克?。?2.73%)缺乏明顯的微衛(wèi)星序列,65個克隆為雷同序列(10.89%),因此本實驗共得到469條含有串聯(lián)重復(fù)序列的

5、獨立克隆,此次FIASCO法的富集效率為78.56%。2.對上述篩選的微衛(wèi)星序列進(jìn)行了特征分析。在469條單一序列中分析得到597個微衛(wèi)星位點。其中完美型為309個,占51.76%;非完美型為207個,占34.67%;復(fù)合型81個,占13.57%。所得到的微衛(wèi)星DNA核心序列的重復(fù)次數(shù)在3~96次之間,平均重復(fù)數(shù)為13.39次,重復(fù)次數(shù)主要集中在3~19次,占78.02%;所篩大菱鲆微衛(wèi)星DNA重復(fù)類型最多是二堿基,占85.25%;重復(fù)單元類別最多的是(CA/GT)n,占77.6%,其次是(AG/CT)n

6、,占11.50%。所篩微衛(wèi)星序列長度主要集中在150bp~349bp之間(81.3%)。此外,還有1個克隆含有重復(fù)單元為八堿基(AGACGGAC)n的串聯(lián)重復(fù)序列,即小衛(wèi)星序列,另兩個克隆分別含有(AC)6(GC(AC)3)6和(TG)14(AGCGCA(TG)5)4重復(fù)序列。3.開發(fā)大菱鲆微衛(wèi)星引物。分析得到的469個微衛(wèi)星位點側(cè)翼序列情況,有384個位點(81.88%)兩端有合適的側(cè)翼序列進(jìn)行引物開發(fā);結(jié)合實際情況共設(shè)計了413對引物,其中有360對能夠得到穩(wěn)定表達(dá)的產(chǎn)物。經(jīng)微衛(wèi)星標(biāo)記初篩試驗,168

7、對引物(46.7%)的擴(kuò)增產(chǎn)物帶型單一,183對引物(50.8%)的PCR產(chǎn)物有多態(tài)性,其中110個微衛(wèi)星位點(30.6%)符合遺傳連鎖圖譜作圖標(biāo)準(zhǔn)。4.進(jìn)行大菱鲆微衛(wèi)星標(biāo)記初篩實驗,以期獲得構(gòu)建大菱鲆遺傳連鎖圖譜的作圖標(biāo)記。通過擬作圖家系的2個親本和6個Fl代個體對748對微衛(wèi)星引物(上述實驗開發(fā)的360對引物和文獻(xiàn)已發(fā)表的388對引物)進(jìn)行初步篩選,1上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文其中有721對引物能夠獲得清晰的擴(kuò)增產(chǎn)物:254對引物的擴(kuò)增產(chǎn)物為單一目的條帶;467對引物擴(kuò)增產(chǎn)物的目的條帶具有多態(tài)性,其中有

8、294個微衛(wèi)星位點符合遺傳圖譜作圖標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)。5.微衛(wèi)星標(biāo)記在作圖家系F1代中的分離模式。從初篩試驗獲得的294個符合作圖標(biāo)準(zhǔn)的微衛(wèi)星位點中,隨機(jī)選取120對微衛(wèi)星引物,在擬作圖家系的2個親本和92個Fl代個體中進(jìn)行標(biāo)記分離情況研究,其中115對引物能夠獲得清晰的擴(kuò)增產(chǎn)物。共得到五種分離模式(♀×♂):abxcd、efxeg、hkxhk、lmxll、nnxnp;每個標(biāo)記分離產(chǎn)生2~4個等位基因,共獲得254個等位基因,平均等位

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